Définition du N filaire

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 7951 (2023) Citer cet article

241 accès

Détails des métriques

La glycosylation N-liée est une modification post-traductionnelle critique des protéines eucaryotes. Les glycanes N-liés sont présents sur les protéines filariennes de surface et sécrétées qui jouent un rôle dans les interactions hôte-parasite. Des exemples de protéines glycosylées de Brugia malayi ont déjà été identifiés, mais il n'y a pas eu d'étude systématique du glycoprotéome lié à l'azote de ce parasite filarien ou de tout autre parasite filarien. Dans cette étude, nous avons appliqué un protocole N-glyco FASP amélioré utilisant une protéine de liaison aux glucides, Fbs1, pour enrichir les peptides N-glycosylés pour analyse par LC-MS/MS. Nous avons ensuite cartographié les N-glycosites sur les protéines de trois stades hôtes du parasite : femelle adulte, mâle adulte et microfilaires. L'enrichissement de Fbs1 en peptides N-glycosylés a amélioré l'identification des N-glycosites. Nos données ont identifié 582 glycoprotéines N-liées avec 1273 N-glycosites. L'ontologie des gènes et la prédiction de la localisation cellulaire des N-glycoprotéines identifiées ont indiqué qu'il s'agissait principalement de protéines membranaires et extracellulaires. En comparant les résultats des vers femelles adultes, des vers mâles adultes et des microfilaires, nous constatons une variabilité de la N-glycosylation au niveau des protéines ainsi qu'au niveau du N-glycosite individuel. Ces variations sont mises en évidence dans les N-glycoprotéines de la cuticule et les N-glycoprotéines restreintes aux vers adultes comme exemples de protéines à l'interface hôte-parasite qui sont bien positionnées en tant que cibles thérapeutiques potentielles ou biomarqueurs.

Brugia malayi est l'un des trois parasites filariens humains qui causent la filariose lymphatique, une maladie tropicale négligée chronique et débilitante qui menace actuellement plus de 859 millions de personnes dans 50 pays à travers le monde1,2. Les symptômes chez les individus peuvent varier de légers à graves, y compris des lésions du système lymphatique et des reins, et éventuellement une obstruction des vaisseaux lymphatiques avec gonflement des organes génitaux et des membres1,2. Les vers adultes résidant dans le système lymphatique des individus immunocompétents peuvent survivre en moyenne 6 à 8 ans. Les vers femelles libèrent des millions de microfilaires (larves immatures), qui se dirigent vers la circulation sanguine où elles peuvent être ingérées en se nourrissant de moustiques, l'insecte vecteur de ces parasites. Chez les moustiques, les microfilaires muent et se développent en plusieurs étapes jusqu'au troisième stade larvaire infectieux (L3) qui peut ensuite être transmis lors d'un repas de sang à d'autres humains. Ces larves L3 muent et mûrissent alors qu'elles migrent vers le système lymphatique où elles complètent leur cycle de vie1,2. Plus de 7 milliards de traitements ont été délivrés dans 66 pays pour lutter contre la filariose lymphatique dans le cadre des efforts de l'OMS pour éliminer la maladie1,3. Les traitements actuels, bien qu'efficaces pour réduire la transmission en diminuant ou en éliminant les microfilaires circulant dans le sang, ne tuent pas les vers adultes responsables des symptômes associés à la filariose3,4. De plus, des rapports faisant état d'une résistance émergente aux traitements actuels ont été faits5,6. Pour étendre les mesures de contrôle disponibles, des études supplémentaires pour augmenter les options de médicaments disponibles et les cibles médicamenteuses sont nécessaires.

Les interactions médiées par les parasites avec l'hôte mammifère telles que l'immunomodulation et l'évasion immunitaire permettent à B. malayi et à d'autres parasites filariens d'exister pendant de nombreuses années chez des hôtes immunocompétents et représentent un domaine d'investigation actif7. Les glycoconjugués présents à la surface du ver, sécrétés, excrétés ou présents dans les vésicules extracellulaires libérées par le parasite dans l'hôte font tous partie de mécanismes cruciaux qui permettent à ces parasites d'exister pendant des années sans clairance8,9,10,11. La caractérisation détaillée de ces molécules critiques et de leurs voies de synthèse peut mettre en évidence des biomarqueurs candidats, des cibles thérapeutiques, des molécules vaccinales ou des outils de diagnostic pour un développement ultérieur. Par exemple, le test de diagnostic actuel de la filariose lymphatique est la détection de l'antigène filarien circulant de Wuchereria bancrofti par un anticorps monoclonal12. Des études récentes ont montré que l'épitope reconnu est un glycane et des études supplémentaires sont nécessaires pour caractériser complètement la structure13.

Une classe importante de glycoconjugués sont les protéines N-glycosylées ou les glycoprotéines N-liées. La N-glycosylation est une modification post-traductionnelle complexe où les glycanes sont attachés à l'azote de résidus d'asparagine spécifiques dans une protéine et jouent un rôle dans de nombreux processus biologiques, notamment le repliement, la stabilité et la fonction de la protéine14. Des exemples de rôles que joue la N-glycosylation dans les interactions hôte-pathogène sont bien établis dans les virus et comprennent le blindage pour permettre l'évasion immunitaire, l'augmentation de l'infectiosité et la modification de la virulence15. En particulier, les N-glycoprotéines de surface qui protègent le virus du système immunitaire de l'hôte comprennent la glycoprotéine d'hémagglutinine de la grippe16, la protéine de pointe de l'enveloppe du VIH-1 (gp120/gp41)17 et la protéine de pointe du SRAS-CoV218. Des stratégies similaires peuvent jouer un rôle dans les parasites métazoaires. De plus, le réseau et la modularité des N-glycanes confèrent un niveau de diversité qui peut être exploité par le parasite pour l'hétérogénéité à court ou à long terme, comme cela a été récemment démontré pour Acanthocheilonema viteae ES-6219 et est probablement important pour les interactions hôte-parasite14, 20. On pense que ces protéines adaptables et modifiées post-traduction du N-glycoprotéome évoluent plus que le protéome de l'organisme et ont moins de conservation avec d'autres espèces21. Ainsi, le N-glycoprotéome du parasite filarien devrait inclure des N-glycoprotéines de surface spécifiques au mode de vie parasitaire et essentielles aux interactions avec l'hôte mammifère.

For parasitic nematodes, the host parasite interface can be defined as the cuticle or outer exoskeleton covering of the worm, excretory-secretory (ES) components, and extracellular vesicles. Early studies of filarial worm cuticle proteins identified two B. malayi glycoproteins. gp29 (Bm2151) is a major surface glycoprotein found in the cuticle of adult worms with homology to the glutathione peroxidases that are part of the oxidative stress response22. gp15/400 (Bm6083 or Bm6084, Bma-npa-1) is a nematode polyprotein allergen related glycoprotein found in the cuticle of the adult worms and is thought to play a role in acquiring the required fatty acids that the worms cannot synthesize de novo22,23. Recently, gp15/400 was described as an immunodominant antigen targeted by human IgE monoclonal antibodies produced from parasite infected human sera24. Later studies broadened the number of cuticle associated proteins but little is known about their glycosylation status25. ES-62 (Bm9816) is a major secreted glycoprotein in filarial nematodes26,27 and of special interest due to immunomodulatory phosphorylcholine substitution of its N-glycans8,9,26. Larger proteomic studies of excreted and secreted proteins28,29, extracellular vesicle proteins30 and membrane or surface enriched proteins31 highlighted more proteins that are exposed to the mammalian host. However, the possibility of glycan-mediated interactions with the host were not addressed in these strictly proteomic analyses. N-linked glycosite mapping in Caenorhabditis elegans, a soil living nematode, identified 829 N-linked glycoproteins in one study and 1010 N-linked glycoproteins in a second21,32. These studies that identified over a thousand N-glycoproteins included all stages (egg, L1, L2, L3, L4, and adult worms) of the nematode life cycle (2015)." href="/articles/s41598-023-34936-9#ref-CR33" id="ref-link-section-d12369696e568">33. Une récente cartographie des glycosites d'un nématode parasite du clade V34, Haemonchus contortus, a identifié 291 glycoprotéines liées au N35 à partir d'un échantillon mixte de vers adultes seulement.

Ici, nous utilisons et développons ces résultats en identifiant et en cartographiant les N-glycosites de B. malayi de protéines à partir de lysats totaux préparés à partir de vers femelles adultes, de vers mâles adultes et de microfilaires pour caractériser le N-glycoprotéome et explorer davantage les protéines au interface des interactions filaires hôtes parasites. De manière significative, nous montrons que nos données incluent des exemples connus de protéines interagissant avec la cuticule et le parasite hôte immunomodulateur. Nous mettons également en évidence deux groupes différents de N-glycoprotéines. Le premier ensemble est un groupe de N-glycoprotéines qui ont dix N-glycosites ou plus. Nous avons utilisé cet ensemble pour explorer la variation d'occupation du N-glycosite parmi les trois types d'échantillons étudiés. Le deuxième ensemble est un groupe de N-glycoprotéines qui sont uniques aux vers femelles et mâles adultes. Nous avons utilisé cet ensemble pour explorer les protéines spécifiques des filaires et des nématodes.

Environ 200 vers femelles, 100 vers mâles ou 2 millions de microfilaires (TRS Labs Inc., Athens GA) ont été remis en suspension dans un tampon de lyse (100 mM Tris HCl pH 7,5, 100 mM DTT, 4 % SDS (v/v)) à 10 ml par 0,3 g de granule de vers humide. Pour commencer la lyse, les échantillons ont été congelés sur de la neige carbonique pendant 10 minutes, puis décongelés à 37 ° C quatre fois avant l'homogénéisation avec un homogénéisateur Dounce en verre. Les échantillons homogénéisés ont ensuite été chauffés à 100 °C pendant 5 min puis refroidis sur de la glace. Les débris cellulaires et les cellules intactes ont été culottés à 15 000 × g pendant 10 min. La concentration en protéines de chaque surnageant a été déterminée à l'aide du kit d'analyse de protéines Pierce™ 660 nm (ThermoFisher Scientific, Waltham MA).

Des peptides tryptiques ont été produits comme décrit précédemment36. En bref, un maximum de 400 µg de chaque lysat protéique a été échangé avec un tampon dans un tampon d'urée (Tris HCl 100 mM, pH 8,2, urée 8 M) à l'aide de filtres centrifuges Microcon 30 K (Millipore Sigma, Burlington, MA). Cela a été suivi par l'alkylation de la cystéine réside avec 50 mM d'iodoacétamide (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) dans le même tampon d'urée dans l'obscurité pendant 20 min. L'iodoacétamide en excès a été lavé puis le tampon a été à nouveau échangé, cette fois dans du bicarbonate d'ammonium 50 mM. Le mélange de protéines a ensuite été digéré avec de la trypsine (P8101S, New England Biolabs, Ipswich, MA) dans un rapport enzyme/protéine de 1:100 à 37°C pendant une nuit et les peptides résultants ont été collectés. La concentration en peptide a été déterminée par le kit de quantification Pierce Colorimetric Peptide Assay. (ThermoFisher Scientific).

Les N-glycopeptides ont été enrichis comme décrit précédemment37. En bref, 100 µg de mélange de peptides de lysat total ont été mélangés avec 200 µg de Fbs1 GYR dans un filtre centrifuge Microcon 30 K et incubés à 4 ° C pendant 2 h. Les peptides non liés ont été éliminés par centrifugation. Après lavage pour s'assurer que tous les peptides non liés ont été éliminés, les peptides N-glycosylés enrichis ont été élués avec de l'acide formique à 50 %. L'élution a ensuite été lyophilisée pour éliminer l'acide formique et l'eau.

Les peptides de 100 µg de mélange de peptides totaux lyophilisés (Total) ou le mélange de peptides enrichi en Fbs1 GYR (Fbs1) à partir de 100 µg de mélange de peptides total de départ ont été remis en suspension dans du bicarbonate d'ammonium 100 mM préparé avec de l'eau 18O (Cambridge Isotope Laboratories, Inc. Andover, MA ). 1000 unités de tampon PNGase F (P0704, New England Biolabs) échangées dans du bicarbonate d'ammonium 100 mM préparé avec de l'eau 18O ont été ajoutées à une réaction finale de 50 µl contenant un mélange de peptides Total ou Fbs1. Les réactions ont été incubées à 37 °C pendant 1 h. Les échantillons ont été exécutés sur LC-MS/MS comme indiqué ci-dessous immédiatement pour éviter les événements de désamidation chimique parasites.

Les peptides de chacun des six échantillons ont été analysés par spectrométrie de masse. Pour chaque échantillon, 6% du volume de peptide résultant a été chargé sur une colonne analytique en phase inversée (colonne Ion Opticks Aurora UHPLC, 25 cm × 75 µm ID, 1,6 µm C18) via un Proxeon Easy-nLC 1000 (Thermo Scientific). La colonne a été logée dans un four à colonne Sonation (Sonation Lab Solutions) et maintenue à 50°C. Les peptides ont été élués sur une fenêtre de trois heures consistant en un gradient linéaire de 156 minutes de 2 à 35 % de B, un gradient de trois minutes à 85 % de B et un flux isocratique à 85 % de B pendant sept minutes où la phase mobile A était de l'eau contenant 0,1 % d'acide formique et la phase mobile B était de l'acétonitrile contenant 0,1 % d'acide formique. Les peptides élués ont été introduits dans un spectromètre de masse Q Exactive (Thermo Scientific) par électrospray à l'aide d'une source d'ions Nanospray Flex (Thermo Scientific) à un débit de 400 nL/min. Les dix ions les plus abondants de chaque balayage complet (résolution de 70 k, plage de balayage de 400 à 1600 m/z) ont été sélectionnés pour la fragmentation par HCD (dissociation collisionnelle à énergie plus élevée) et les spectres de fragmentation ont été acquis avec une résolution de 35 k. Une énergie de collision normalisée échelonnée de 20, 30 et 40 a été utilisée. Les états de charge de un et supérieurs à huit ont été exclus. L'exclusion dynamique a été fixée à 30 s. Chaque échantillon a été analysé avec trois répétitions techniques et les spectres de chaque ensemble en triple ont été combinés pour analyse.

Les données spectrales ont été recherchées par rapport au protéome combiné de B. malayi (brugia_malayi.PRJNA10729.WBPS10.protein.fa) de Wormbase38 et à l'endosymbiote Wolbachia du protéome de B. malayi de NCBI39, tous deux téléchargés en décembre 2019 puis analysés à l'aide du logiciel Byonic (Protein Metrics , Cupertino, Californie). Les contaminants courants tels que les kératines, les caséines, la trypsine et la BSA ont été retirés de l'analyse. La production de protéines a été fixée à 1 % de FDR. Les autres paramètres utilisés pour chaque ensemble de données de spectrométrie de masse étaient Site de clivage = RK, côté C-terminal = semi-spécifique ; clivage manqué = 2 ; Tolérance de masse = 10 ppm ; Fragmentation QTOF/HCD avec une tolérance de masse de fragment de 0,02 Da. Modifications fixes = carbamidométhyl @ C/ + 57.021464. Modifications variables = désamidée :18O(1) / + 2,988261 @ N, oxydation/ + 15,994915 @ M, désamidée / + 0,984016 @ N et Q, acétyle @Protein N-term / + 42,010565, Gln- > pyro-Glu/ -17,026549 , amidée @ D et E / -0.984016. Les données de protéomique de spectrométrie de masse ont été déposées auprès du Consortium ProteomeXchange via le référentiel partenaire PRIDE40 avec l'identifiant de jeu de données PXD039002 et 10.6019/PXD039002.

Nous avons filtré les résultats de sorte que les peptides devaient avoir un score Byonic> 200 et une longueur de peptide> 4 pour les échantillons enrichis en Fbs1. Pour les échantillons totaux, qui avaient une complexité plus élevée, nous avons utilisé un score Byonic > 300 et une longueur de peptide > 4. Le score Byonic est un indicateur de la précision de la correspondance du spectre peptidique41. Les peptides uniques uniques qui étaient associés à une seule protéine, dans un réplicat de l'échantillon, et qui n'étaient pas présents dans les cinq échantillons restants sont marqués par un astérisque dans le tableau supplémentaire S1 et ne sont pas inclus dans l'analyse ultérieure des données. Pour comparer les protéines identifiées par LC-MS/MS à des études protéomiques précédemment publiées28,29,30,31,42,43 qui utilisaient différents identifiants de protéines, nous avons croisé les bases de données Wormbase38 et UniProt44 pour corréler Wormbase ID de nos données au PUB_loci /pub_locus numéros ou à l'identifiant UniProtKB pour le protéome de B. malayi et à la base de données UniProt pour corréler l'identifiant NCBI avec l'identifiant UniProtKB ou les numéros de gène wBm pour le protéome de Wolbachia. Les synonymes que nous avons trouvés associés à chaque protéine de notre ensemble de données utilisé pour les références croisées sont répertoriés dans le tableau supplémentaire S2.

We used NetNGlyc-1.046 to find the canonical N-X-S/T glycosites present in each N-glycoprotein. We used Weblogo47 to create a sequence logo for extracted -10 to + 10 amino acid sequences. We used BioVenn48 to generate a proportional Venn diagram. We used TMHMM-2.049 to predict transmembrane domains. We used UpsetR50 to generate UpsetR intersecting set plots. The gene ontology identification and functional enrichment analysis was performed using g:Profiler (version e105_eg52_p16_e84549f.) with g:SCS multiple testing correction method applying significance threshold of 0.0551. We used ggplot (2016)." href="/articles/s41598-023-34936-9#ref-CR52" id="ref-link-section-d12369696e755"> 52 pour générer des diagrammes de dispersion à partir de l'analyse des données d'enrichissement génétique. Nous avons utilisé DeepLoc pour prédire la localisation subcellulaire de chaque N-glycoprotéine53. Nous avons utilisé Parasite Biomart à Wormbase pour rechercher à la fois les orthologues de C. elegans et de H. contortus aux N-glycoprotéines identifiées de B. malayi54. Nous avons utilisé Clustal Omega pour générer un alignement de séquences multiples55.

La méthode N-glyco FASP améliorée utilise un mutant Fbs1-GYR qui se lie spécifiquement aux peptides N-glycosylés. Cette protéine modifiée est sélective pour une large gamme de glycopeptides liés à N et s'est avérée avoir un enrichissement 2,2 fois plus élevé et moins de biais par rapport au protocole N-glyco FASP standard qui utilise un mélange de lectines ConA, WGA et RCA12037. Il a également été montré que la méthode d'enrichissement en Fbs1 est plus adaptée à l'analyse des N-glycosites que les méthodes moins sélectives (HILIC ou hydrazide) qui permettent l'enrichissement en glycanes O-liés ou autres molécules hydrophiles37.

Nous avons analysé des échantillons traités avec la PNGase F en présence d'eau 18O à partir d'échantillons de protéome total non enrichis (Total) et d'échantillons post-enrichissement en Fbs1 (Fbs1) par LC-MS/MS pour les vers femelles adultes, les vers mâles adultes et les microfilaires. La PNGase F est une peptide N-glycosidase qui libère spécifiquement de l'oligomannose, des glycanes hybrides et des glycanes complexes attachés à une asparagine par clivage au niveau de la liaison amide56. Le clivage du glycane avec la PNGase F dans de l'eau 18O génère un événement de désamidation lorsque l'asparagine est convertie en acide aspartique avec l'incorporation de 18O. Il en résulte une addition de + 2,98 Dalton sur la séquence primaire d'acides aminés du peptide 57 facilement détectée par spectrométrie de masse. Les peptides contenant une asparagine avec cette addition de + 2,98 Dalton sont appelés ci-après peptides N+3. Sans eau 18O, le clivage de la PNGase F entraîne une désamidation de + 0,98 Dalton qui peut également être le résultat d'une désamidation spontanée indésirable de l'asparagine pendant le traitement de l'échantillon. Bien que la PNGase F soit incapable de libérer des N-glycanes lorsque l'α (alpha) 1–3 fucose est présent sur le noyau N-acétyl glucosamine (GlcNAc) d'un N-glycane, nous n'avons pas utilisé de deuxième enzyme comme la PNGase A parce que α La (alpha) 1-3 fucosylation du noyau GlcNAc est absente chez B. malayi58 et d'autres nématodes filariens59.

L'utilité de l'enrichissement en Fbs1 est illustrée sur la figure 1a où le nombre et le pourcentage de spectres de peptides correspondent avec et sans modification N + 3 dans chaque échantillon sont résumés. Les données complètes se trouvent dans le tableau supplémentaire S1. Comme détaillé dans la section "Matériels et méthodes", pour nous assurer que nous pouvions comparer les échantillons, nous avons normalisé les entrées en déterminant la concentration de peptide pour tous les échantillons avant l'enrichissement. L'enrichissement en Fbs1 améliore à la fois le nombre global de peptides N-glycosylés et la qualité des données. Sans enrichissement, le nombre de peptides N+3 dans les échantillons Total est limité à 1% à 3% de tous les peptides. Même avec des dizaines de milliers de peptides identifiés dans les échantillons totaux, le nombre final de peptides N + 3 identifiés se situe entre 45 et 241 avec le moins présent dans l'échantillon de vers mâles. Les échantillons enrichis en Fbs1, en revanche, ont 213 à 1366 peptides N + 3 représentant une multiplication par quatre à cinq des données disponibles sur les peptides N + 3 par rapport aux échantillons totaux. De plus, pour définir les peptides N + 3 comme des N-glycosites, nous avions besoin d'un motif de site de N-glycosylation canonique, NXS/T, où X pourrait être n'importe quel acide aminé autre que la proline21. (La séquence NXS/T sera désignée ci-après comme un N-glycosite canonique et un peptide N + 3 avec un site de N-glycosylation canonique sera désigné comme un N-glycosite identifié. Les N-glycosites identifiés spécifiques seront listés avec la position de l'asparagine dans la séquence d'acides aminés suivie de sa séquence NXS / T. par exemple, 67 NET) Ainsi, pour être un N-glycosite identifié, tous les peptides N + 3 ont été évalués pour inclure un N-glycosite canonique et sont notés sur la figure 1a en orange. Ces résultats illustrent la puissance et l'utilité de la méthode d'enrichissement Fbs1 dans l'identification des N-glycosites car il existe une forte concordance de la modification N + 3 avec un N-glycosite canonique dans les échantillons enrichis en Fbs1. Dans les trois échantillons Fbs1, 74 à 87 % de tous les peptides de l'échantillon ont une modification N + 3 présente sur un N-glycosite canonique. La figure 1c se concentre sur les peptides avec modification N + 3 et montre que le pourcentage de peptides modifiés N + 3 avec un N-glycosite canonique dans les échantillons Fbs1 est de 98 à 99%. Dans les échantillons totaux avec une complexité d'échantillon plus élevée, la concordance est considérablement plus faible. De manière attendue, seuls 0,7% à 1,6% de tous les peptides de ces échantillons non enrichis ont une modification N + 3 présente sur un N-glycosite canonique (Fig. 1a). Cependant, même lorsque seuls les peptides avec une modification N + 3 sont analysés, seuls 51 à 84% des peptides modifiés N + 3 dans les échantillons totaux sont trouvés avec un N-glycosite canonique (Fig. 1c). Ce fond plus élevé est malgré un seuil de score Byonic plus élevé pour les peptides des échantillons totaux utilisés pour augmenter la stringence. Par conséquent, l'enrichissement des peptides par Fbs1 augmente à la fois le nombre de N-glycosites identifiés et diminue le bruit de fond.

Enrichissement Fbs1. Chaque barre représente la moyenne des correspondances du spectre peptidique dans (a) ou la moyenne des protéines identifiées dans (b) des échantillons totaux (sans enrichissement) ou enrichis en Fbs1 pour les vers femelles, ♀, les vers mâles, ♂ et les microfilaires, Mf. En gris clair, marqués Non N+3, se trouvent les peptides ou protéines sans la modification N+3. En gris foncé, étiquetés N + 3 : Autres, sont les N + 3 non canoniques contenant des peptides ou des protéines sans glycosite NXS/T. En orange marqué N + 3 : NXS/T sont les peptides ou protéines N-glycosite avec à la fois une modification N + 3 et un glycosite NXS/T canonique associé. Le pourcentage en gris foncé à côté de la barre représente le pourcentage N + 3 : Autre dans l'ensemble de l'échantillon. Le pourcentage en orange à côté de la barre représente les peptides ou protéines N + 3 : NXS/T dans l'ensemble de l'échantillon. Les diagrammes circulaires représentent le pourcentage d'autres par rapport à NXS/T pour les peptides N + 3 en (c) ou les protéines contenant des peptides N + 3 en (d).

Les résultats d'enrichissement Fbs1 sont reflétés lorsque l'on regarde les résultats au niveau des protéines. Les protéines identifiées par un seul peptide unique dans un seul réplicat des six échantillons ont été exclues de notre analyse (tableau supplémentaire S1, * peptides uniques). Dans les échantillons enrichis en Fbs1, un pourcentage plus élevé de protéines avait une modification N + 3 et variait de 78 à 88 %, comme le montre la figure 1b. En revanche, dans les échantillons totaux, la modification N + 3 n'a été trouvée que dans 4% des protéines de vers mâles et 13 à 18% des protéines de vers femelles et microfilaires. Pour les échantillons totaux, la figure 1d montre qu'il y avait des nombres relativement similaires de protéines contenant des peptides N + 3 sans un N-glycosite canonique comme il y en avait avec une séquence NXS/T. Avec l'enrichissement en Fbs1, seulement 1 à 6 % des protéines avaient des peptides N + 3 sans N-glycosite canonique. Cela se traduit par quatre à cinq fois plus de protéines N-glycosylées identifiées dans les échantillons enrichis en Fbs1 par rapport aux échantillons totaux ou non enrichis avec des quantités d'entrée équivalentes analysées.

Au total, plus de 2000 protéines différentes ont été identifiées dans les six échantillons analysés (tableau supplémentaire S2). Après avoir extrait toutes les protéines avec une modification N + 3 et nécessitant un N-glycosite canonique, nous avons identifié 582 protéines N-glycosylées avec 1273 glycosites N-liés (tableau supplémentaire S3). Il convient de noter que ces données ont été générées à partir de répliques techniques d'un échantillon regroupé de vers femelles, de vers mâles et de microfilaires. En comparaison, avec plus de 1000 N-glycoprotéines dans les N-glycoprotéomes de C. elegans21,32 qui englobent toutes les étapes de la vie et le N-glycoprotéome de H. contortus avec 282 N-glycoprotéines35 qui représentent des échantillons de vers adultes, nous pensons que ce B. malayi N -glycoprotéome d'échantillons de vers adultes et de microfilaires fournit un bon aperçu du N-glycoprotéome filarien présent au stade de l'hôte mammifère.

Comme cela est courant avec d'autres N-glycoprotéomes étudiés, la distribution des N-glycosites a favorisé NXT avec 791 sites (62%) par rapport à NXS avec 482 sites (38%)21. Nous avons extrait les séquences de 10 acides aminés en amont et en aval des N-glycosites identifiés pour rechercher des motifs conservés supplémentaires47 (tableau supplémentaire S3, figure supplémentaire S1). Les données ont montré le NXS/T attendu où X pourrait être n'importe quel acide aminé mais la proline et aucun motif supplémentaire. Des protéines de l'endosymbionte Wolbachia ont été trouvées dans les échantillons, mais comme prévu, nous n'avons identifié aucune d'entre elles en tant que N-glycoprotéines (tableau supplémentaire S2).

53% des N-glycoprotéines ont un glycosite N-lié tandis que les autres ont deux glycosites N-liés ou plus (Fig. 2a). Huit protéines avaient dix glycosites N-liés ou plus et sont répertoriées dans le tableau 1. Ces protéines hautement glycosylées démontrent le nombre accru de N-glycosites qui peuvent être découverts en utilisant l'enrichissement en Fbs1. Pour les huit protéines, il y a plus de N-glycosites identifiés dans les échantillons Fbs1 que dans les échantillons totaux. Bien que le nombre accru de N-glycosites révélé par l'enrichissement en Fbs1 soit facilement apparent dans les protéines hautement glycosylées, cette tendance reste la même pour la plupart des N-glycoprotéines. En fait, seuls 33 ou 2,6% des 1273 N-glycosites ont été exclusivement trouvés dans les échantillons Total mais pas dans les échantillons Fbs1. Ces quelques protéines sont notées par un astérisque dans les colonnes d'échantillons du tableau supplémentaire S3.

N-glycoprotéines (a) La distribution des N-glycoprotéines qui ont 1 à 10 + N-glycosites. ( b ) Comparaison du chevauchement du diagramme de Venn proportionnel à la surface des 582 N-glycoprotéines identifiées à partir de quantités standardisées de vers femelles B. malayi, de vers mâles et de microfilaires analysés dans cette étude.

Une autre caractéristique notable du tableau 1 est la variabilité de l'occupation du N-glycosite d'un échantillon à l'autre. Le nombre total de N-glycosites identifiés dans les six échantillons est répertorié dans la 6e colonne intitulée Tous. La comparaison de ce total aux N-glycosites trouvés dans les échantillons individuels montre la variation des N-glycosites entre ces échantillons. Pour deux protéines, Bm2376a et Bm6131, le total des N-glycosites identifiés correspond au total trouvé dans les microfilaires. Un plus petit sous-ensemble de ces N-glycosites, cependant, se trouve dans les vers mâles et femelles adultes. Pour les six autres protéines, il existe un mélange de N-glycosites individuels et superposés qui totalisent le nombre total dans tous les échantillons.

La figure 3 illustre la variabilité de l'occupation du N-glycosite pour Bm7191. Cette protéine est supposée être une protéine membranaire avec les 604 premiers acides aminés de la protéine orientés à l'extérieur de la membrane et une seule région transmembranaire de 605 à 627 surlignée en gris60. Il possède 22 N-glycosites canoniques, tous trouvés dans la région supposée être à l'extérieur de la membrane46. Alors qu'un total de 12 N-glycosites ont été identifiés, la cartographie sur la séquence protéique montre qu'un seul site à 67 NET est occupé par les vers femelles, les vers mâles et les microfilaires. Dans les microfilaires, deux N-glycosites à 26 NGS et 145 NKT sont occupés de manière unique et chez les vers femelles, deux autres N-glycosites à 120 NFT et 443 NDS sont occupés de manière unique. Les sept sites restants sont occupés à la fois par des vers femelles et des microfilaires. Deux sites à 345 NAS et 443 NDS étaient en dessous du seuil fixé pour la prédiction de N-glycosite mais ont été identifiés comme N-glycosites, ce qui montre que le seuil de prédiction de N-glycosite dans certains cas peut devoir être abaissé. La variabilité de l'occupation du N-glycosite doit être explorée plus avant pour déterminer sa signification biologique.

Occupation N-glycosite de Bm7191 : la séquence protéique complète de Bm7191 est indiquée avec la région transmembranaire prédite surlignée en gris49. Les sites NXS / T sont colorés en bleu dans la séquence protéique s'ils sont prédits comme un N-glycosite et colorés en rouge si le seuil déterminé par accord du jury à l'aide de neuf réseaux de neurones et un score supérieur à un seuil défini par NetNGlyc-1.046 n'a pas été atteint. Les N-glycosites trouvés dans les vers femelles (♀ de couleur rouge), les vers mâles (♂ de couleur verte) et les microfilaires (mf de couleur bleue) sont indiqués au-dessus de la séquence.

Le chevauchement des protéines observées comme étant N-glycosylées chez les mâles, les femelles et les microfilaires est illustré à la Fig. 2b. Alors que 81 ou 14% des protéines se trouvent N-glycosylées dans les trois échantillons, près de la moitié des protéines (32% chez les microfilaires, 12% chez la femelle et 3% chez le mâle) ne sont N-glycosylées que dans un des trois échantillons . Le plus grand chevauchement de 34% de toutes les N-glycoprotéines se situe entre le ver femelle et les échantillons de microfilaires. Ce chevauchement est probablement confondu par les microfilaires intra-utérines présentes dans les vers femelles et doit être gardé à l'esprit lorsque des N-glycosites spécifiques sont trouvés en commun entre la femelle et les microfilaires dans des N-glycoprotéines individuelles. Parmi les trois types d'échantillons étudiés ici, les microfilaires ont le plus grand nombre de N-glycoprotéines à 477 et les N-glycoprotéines les plus uniques à 188. Cela pourrait être dû au fait que les microfilaires doivent échapper au système immunitaire lors de la migration des lymphatiques vers la circulation périphérique et se développer ultérieurement au sein d'un moustique vecteur. Les vers mâles ont le moins de N-glycoprotéines ainsi que le moins de N-glycosites (Tableau 1, Fig. 1a, c). On ne sait pas ce qui est responsable de ce niveau inférieur observé de N-glycosylation. Néanmoins, il existe 17 N-glycoprotéines de vers mâles qui ne sont pas N-glycosylées dans les échantillons Total ou Fbs1 de vers femelles adultes ou de microfilaires.

En comparant les 582 protéines glycosylées liées à N aux protéomes de B. malayi précédemment publiés, nous avons trouvé 111 protéines (19%) n'avaient été identifiées auparavant dans aucune étude protéomique (Fig. 4, No Match). Cela montre la puissance de l'enrichissement en Fbs1 pour extraire le protéome des protéines peu abondantes ou difficiles à trouver. Notre identification des protéines N-glycosylées ajoute également un contexte aux protéomes précédemment publiés ; nous avons ajouté le statut de glycosylation à 471 protéines rapportées précédemment. Par exemple, 136 N-glycoprotéines chevauchaient des protéomes sécrétoires excréteurs et 188 chevauchaient un protéome membranaire. Ces informations peuvent nous aider à comprendre où se trouvent ces N-glycoprotéines et à quel stade elles sont présentes dans le ver.

Analyse des données UpSetR des N-glycoprotéines identifiées de B. malayi avec des protéomes de B. malayi précédemment publiés : EV 201830 est le protéome de la vésicule extracellulaire. ES 200829 et ES 200928 sont les ensembles de protéomes excréteurs et sécrétoires. Membrane. 201931 est les ensembles de protéomes de surface et de membrane ; BDR 201542 est la paroi corporelle, le tube digestif et les ensembles de protéomes de l'appareil reproducteur. SS 201143 est les ensembles de protéomes spécifiques à l'étape. Aucune correspondance indique des N-glycoprotéines identifiées non trouvées dans ces six études protéomiques. La taille de l'ensemble indiquée à gauche indique le nombre de protéines dans chaque ensemble. Les barres qui sont au-dessus des points simples montrent le nombre de protéines N-glycosylées uniques à ce protéome. Les barres qui sont au-dessus de plusieurs points joints montrent le nombre de protéines N-glycosylées en commun avec ces protéomes50.

Pour analyser les données d'enrichissement de gènes et explorer les informations de fonction et de localisation, l'annotation des données d'ontologie des gènes pour les protéines N-glycosylées a été obtenue et l'analyse d'enrichissement de gènes a été effectuée à l'aide de g: Profiler51 (tableau supplémentaire S4, figure 5a). Bien qu'absentes pour environ un tiers ou 179 des glycoprotéines liées à N, 403 glycoprotéines liées à N avaient une annotation d'ontologie de gène ou des informations sur la voie KEGG45. Cela comprenait l'annotation des composants cellulaires pour 329 ou 57 % des N-glycoprotéines où l'analyse d'enrichissement montre que les protéines associées à la membrane, les protéines extracellulaires ou de surface cellulaire sont surreprésentées ; Annotation du processus biologique pour 148 ou 25 % des N-glycoprotéines et annotation de la fonction moléculaire pour 123 ou 21 % des N-glycoprotéines où les protéines impliquées dans la protéolyse, la glycosylation et l'adhésion sont surreprésentées. De même, les voies KEGG45 importantes dans la glycosylation et la dégradation des protéines sont également surreprésentées. Comme prévu pour les protéines N-glycosylées, cela confirme que ces protéines ont des caractéristiques attendues dans les protéines interagissant avec le parasite hôte.

Prédiction et analyse de l'ontologie des gènes et de la localisation subcellulaire (a) : les diagrammes de dispersion illustrent les termes GO enrichis et les voies de la base de données KEGG. L'axe vertical représente les termes enrichis dans chaque catégorie et l'axe horizontal représente la valeur p d'enrichissement. La valeur p était plafonnée à 16, comme indiqué par la ligne verticale pointillée sombre. La taille des points indique le numéro du gène et la couleur indique le type d'échantillon. GO: BP set sont les meilleurs termes d'ontologie de gène de processus biologique, GO: CC set sont les meilleurs termes d'ontologie de gène de composant cellulaire, GO: MF sont les meilleurs termes d'ontologie de gène de fonction moléculaire et l'ensemble KEGG sont les principales voies KEGG (b): Le graphique à barres proportionnel indique le nombre de N-glycoprotéines dans dix emplacements subcellulaires différents, l'orange indiquant les protéines membranaires prédites et le gris indiquant les protéines solubles.

De plus, nous avons utilisé DeepLoc-1.0 qui utilise un algorithme basé sur la séquence pour prédire la localisation subcellulaire53. Cette annotation a étendu les prédictions de localisation subcellulaire à l'ensemble des 582 protéines (tableau supplémentaire S5). Plus de 50% des protéines devraient être des protéines membranaires et sont principalement divisées en membrane cellulaire, réticulum endoplasmique, Golgi et lysosome / vacuole (Fig. 5b). Sur les 278 N-glycoprotéines restantes qui devaient être des protéines solubles, environ la moitié seraient des protéines extracellulaires. L'ontologie des gènes, les prédictions de localisation subcellulaire et les informations des études protéomiques précédentes aident à évaluer les N-glycoprotéines pour leurs interactions potentielles avec le parasite hôte.

Les deux protéines cuticulaires mentionnées précédemment, gp29, une glutathion peroxydase probable et gp15/400, une protéine apparentée à l'allergène polyprotéique de nématode, sont présentes dans tous les échantillons analysés. La cartographie du glycosite de gp29 (Bm2151a) indique une N-glycosylation variable ; dans les échantillons de vers femelles où cette protéine est abondante (40 peptides uniques dans l'échantillon Total et 36 peptides uniques dans l'échantillon Fbs1), les deux N-glycosites canoniques46 à 39 NQT et 92 NGT sont glycosylés dans les échantillons Total et Fbs1 tandis que dans les vers mâles ( 8 peptides uniques dans l'échantillon Total et 4 peptides uniques dans l'échantillon Fbs1), les peptides dans les échantillons Total et Fbs1 montrent que seul le site 39 est glycosylé et dans les microfilaires (4 peptides uniques dans l'échantillon Total et 2 peptides uniques dans l'échantillon Fbs1) les peptides dans l'échantillon Fbs1 montrent que seul le site 92 est glycosylé. Étant donné qu'aucun peptide aglycosylé qui chevauche le site 92 dans les échantillons totaux mâles ou le site 39 dans les échantillons totaux de microfilaires n'est identifié, nous ne pouvons pas confirmer de manière concluante l'absence de glycosylation, mais nous nous attendrions à ce que l'enrichissement en Fbs1 ait enrichi ces peptides s'ils avaient été N-glycosylés. Comme indiqué précédemment, nous ne pouvons pas différencier dans les échantillons féminins si le N-glycosite est présent uniquement dans les tissus féminins, dans les microfilaires intra-utérines ou dans les deux. Ainsi, dans ce cas, le site 92 dans l'échantillon féminin peut être dû à la microfilaire intra-utérine. Avec 58 peptides uniques identifiés chez les femmes Total, 26 peptides uniques chez les hommes Total et 17 peptides uniques chez les microfilaires Total, gp15/400 (Bm6084) est une protéine cuticulaire relativement abondante. Il est rapporté qu'il se lie aux lipides et possède 16 répétitions multiples en tandem d'un domaine ABA-122,23 spécifique aux nématodes qui contient un seul N-glycosite canonique dans le domaine de répétition. Nos données montrent que ce glycosite NLT se trouve à la fois aglycosylé et glycosylé dans les échantillons femelles et microfilaires et glycosylé dans les échantillons mâles. En raison des répétitions en tandem, cependant, nous ne pouvons pas déterminer combien de ces 16 N-glycosites répétés sont occupés. De plus, gp15/400 a 8 autres N-glycosites canoniques 46 non situés dans les répétitions en tandem. Quatre de ces sites à 139 NDS, 359 NGS, 527 NVT et 2867 NHS sont glycosylés dans les vers femelles, tandis que trois sites aux positions 139, 359 et 527 sont glycosylés dans les microfilaires et seulement deux à 527 et 2867 sont glycosylés dans les vers mâles. En revanche, l'orthologue de C. elegans, npa-1, avec un phénotype ARNi à durée de vie prolongée61 a des répétitions en tandem mais pas de N-glycosites canoniques46 ouvrant la possibilité que la N-glycosylation de gp15/400 ait un rôle spécialisé dans B. malayi.

Nous avons également vérifié d'autres protéines de la cuticule identifiées par Page et al. comme cibles potentielles de biosynthèse de la cuticule et de mue25 et mettent en évidence trois N-glycoprotéines supplémentaires de la cuticule. Premièrement, Bma-PHY-1 (Bm3843) s'est avéré important pour le développement de la cuticule grâce à des études d'ARNi chez B. malayi62. C'est un orthologue du dpy-18 de C. elegans qui est une sous-unité α de la prolyl-4-hydroxylase importante dans la biosynthèse du collagène63,64. C. elegans dpy-18 s'est également avéré être N-glycosylé bien qu'à un glycosite différent21. Des peptides pour Bma-PHY-1 ont été trouvés dans des échantillons de femelles, de mâles et de microfilaires, mais sur 2 N-glycosites canoniques possibles, des peptides glycosylés n'ont été trouvés que pour le glycosite à 157 NAS et uniquement dans des échantillons de femelles et de microfilaires. Deuxièmement, Bm-MLT-7 (Bm7474) est un orthologue de C. elegans mlt-7 qui a un phénotype de létalité larvaire précoce ARNi. Il est prévu qu'il ait une activité de liaison à l'hème et une activité de peroxydase essentielle importantes pour la synthèse de la cuticule et la mue65, et il est démontré qu'il est N-glycosylé sur les deux N-glycosites canoniques présents dans la protéine21. Dans nos données, des peptides pour Bm-MLT-7 ont été trouvés dans des échantillons féminins, masculins et microfilariens et alors que les deux N-glycosites canoniques à 95 NST et 477 NIS étaient N-glycosylés dans les échantillons féminins, seuls 95 étaient N-glycosylés dans les microfilaires. . Troisièmement, Bm-CPZ-1 (Bm3754) devrait être une cystéine protéase à base de cathepsine importante dans l'ecdysis, le développement de la cuticule et la morphogenèse du corps post-embryonnaire avec un phénotype ARNi chez B. malayi de libération réduite de microfilaires66. Ses orthologues, C. elegans cpz-1 et O. volvulus cpz-1, ont des phénotypes ARNi montrant des défauts de mue67,68. Il a été démontré que C. elegans cpz-1 est N-glycosylé sur un site21. Dans nos données, cette protéine a été trouvée dans les trois ensembles de données et des peptides N-glycosylés pour le seul N-glycosite canonique à 187 NYT ont été trouvés dans les vers femelles et les microfilaires. Bien qu'il n'y ait aucune confirmation des peptides aglycosylés, l'absence de N-glycosylation trouvée dans les échantillons Fbs1 mâles pour ces trois protéines de la cuticule renforce à la fois le niveau de glycosylation inférieur observé chez les vers mâles et la variabilité de la N-glycosylation des protéines entre les vers mâles et les vers femelles. , et les microfilaires.

Des études antérieures ont identifié ES-62, Bm-mif-1, Serpin et BmVal1 comme des protéines importantes qui modulent le système immunitaire de l'hôte28. ES-62 (Bm9816) est une leucyl aminopeptidase prédite avec une activité immunomodulatrice de l'hôte qui a été liée à la phosphorylcholine sur ses N-glycanes27,28. Récemment, l'état de N-glycosylation de l'A. viteae ES-62 d'un échantillon adulte mixte a été caractérisé et a montré à la fois l'hétérogénéité des glycanes contenant du PC et des différences d'occupation des sites au niveau des quatre sites de N-glycosylation de la protéine19. Alors que A. viteae ES-62 et Bm9816 sont identiques à 71 % par BlastP39, leurs N-glycosites ne se chevauchent pas, soulignant que même avec des protéines à haut niveau d'identité, les N-glycosites peuvent également différer. Dans nos données, Bm9816 se trouve dans les trois ensembles de données, mais bien qu'il soit relativement abondant dans l'échantillon féminin (20 peptides uniques dans l'échantillon total) et dans l'échantillon microfilaire (17 peptides uniques dans l'échantillon total), un seul peptide unique a été identifié dans le échantillon masculin. Des peptides N-glycosylés pour 4 N-glycosites à 30 NDT, 128 NIT, 146 NVS, 241 NHT ont été trouvés pour ES-62 dans les échantillons femelles et microfilariens sur 6 possibles N-glycosites canoniques présents dans la protéine. Le N-glycosite à 241 NHT est l'un des rares cas où un N-glycosite était présent à la fois dans les échantillons de Total femelle et de Total de microfilaires et pas dans l'un ou l'autre des échantillons Fbs1. Aucun peptide glycosylé n'a été identifié dans l'échantillon mâle. Bm-mif-1 (Bm6870) est un facteur inhibiteur de la migration des macrophages sécrété par les filaires et s'est avéré être un antigène majeur de l'infection par les vers parasites24,69. Cette protéine est relativement abondante dans les échantillons totaux (19, 8, 22 peptides uniques chez les femelles, les mâles et les microfilaires, respectivement) mais n'a pas été trouvée dans les échantillons enrichis en Fbs1 indiquant qu'au moins dans les vers adultes et les microfilaires, Bm-mif-1 n'est pas N-glycosylé même s'il possède deux N-glycosites canoniques. Il se peut qu'il soit N-glycosylé à un stade de vie différent ou dans des conditions non étudiées ici. La serpine (Bm9380) est un inhibiteur de la sérine protéase microfilarienne dont on pense qu'il agit sur les enzymes des neutrophiles humains70. Comme prévu, les peptides de Serpin n'ont pas été trouvés dans les ensembles de données femelles ou mâles, mais étaient présents dans les échantillons enrichis en microfilaires Total et Fbs1 avec N-glycosylation identifiée aux deux N-glycosites canoniques, 21 NST et 266 NSS. BmVal1 (Bm4233b) s'est avéré être une protéine importante dans les interactions hôte-parasite avec une forte réponse anticorps de l'hôte71. En outre, dans une récente étude transcriptomique spatiale de B. malayi, BmVal1 a été identifié parmi les transcrits de gènes enrichis en tête de femme importants pour les comportements alimentaires, sensoriels, sécrétoires et reproducteurs et constitue donc une cible prometteuse pour les vers adultes72. La glycoprotéine BmVal1 a 2 N-glycosites canoniques et a été produite par recombinaison dans des cellules végétales avec les deux sites glycosylés et sa structure protéique a été déterminée71. Dans notre étude, les deux N-glycosites à 52 NGT et 138 NLT étaient glycosylés dans les échantillons femelles et microfilaires tandis que dans les échantillons mâles, il n'y avait que des données pour confirmer que le deuxième site à 138 est glycosylé.

Bm5654 est un orthologue d'une aminopeptidase (antigène H11) qui s'est avéré être une partie importante d'un extrait immunoprotecteur chez H. contortus73,74. Cette protection a été liée à la N-glycosylation74. Bm5654 se trouve dans les trois ensembles de données et est abondant dans l'échantillon féminin (43 peptides uniques dans l'échantillon total) et dans l'échantillon masculin (12 peptides uniques dans l'échantillon total), mais un seul peptide unique a été identifié dans l'échantillon total de microfilaires. Des peptides N-glycosylés pour 8 N-glycosites ont été trouvés dans les échantillons féminins sur 15 possibles N-glycosites canoniques présents dans la protéine à 83 NVS, 115 NLT, 133 NMT, 265 NET, 419 NQT, 440 NIS, 789 NLT, et 970 NDS. Un seul N-glycosite à 970 a été identifié dans les échantillons mâles. Même s'il est moins abondant dans l'échantillon de microfilaires, l'enrichissement en Fbs1 a montré que cette protéine était N-glycosylée sur 6 N-glycosites, dont un à 241 NIT non trouvé dans les échantillons de femelles. L'alignement de Bm5654 avec son orthologue H. contortus (41 % d'identité) à l'aide de BlastP39 montre que seul le dernier des 8 N-glycosites identifiés à 970 est partagé et est NSS dans l'antigène H11 de H. contortus.

Pour examiner les protéines de parasites adultes et éviter les protéines qui peuvent apparaître dans les échantillons femelles en raison des microfilaires intra-utérines, nous nous sommes concentrés sur les 15 N-glycoprotéines qui sont N-glycosylées dans les vers femelles et mâles mais qui n'ont pas de peptides identifiés dans les échantillons microfilaires Total ou Fbs1. (Fig. 2b, Tableau 2). Étant donné que ces échantillons étaient des lysats de vers entiers, il n'est pas possible de distinguer l'occupation partielle d'un N-glycosite en tant que N-glycosylation spécifique au tissu ou la présence de deux protéines glycosylées de manière différentielle dans le même tissu.

Bm14109 est un exemple d'une protéine relativement abondante (98 peptides uniques chez les femelles totales et 47 peptides uniques chez les mâles totaux) avec des schémas de N-glycosylation variables trouvés chez les vers mâles et femelles adultes mais non trouvés dans les microfilaires. Cette protéine est une protéine de transport de lipides basée sur l'ontologie des gènes. Dans des études protéomiques précédentes, il a été trouvé dans des vésicules extracellulaires femelles adultes 30, des échantillons de surface de vers adultes 31 et des échantillons de membrane 31 signifiant une possible interaction hôte-parasite. Ceci est renforcé par une récente étude transcriptomique spatiale, où il s'enrichit dans la tête, une interface hôte-parasite médicamentable, ainsi que dans l'intestin où sont présents des candidats médicaments et vaccins issus des « antigènes cachés » restreints au tube digestif72. Dans notre étude, huit des 12 glycosites liés à N canoniques ont été identifiés chez les vers adultes femelles aux sites 131 NNT, 548 NET, 634 NFT, 1187 NRT, 1524 NAT, 1638 NLT, 1692 NLS et 1840 NES avec le site à la position 1840 également trouvé aglycosylé dans les échantillons Total féminins et masculins. Présentant une variabilité de la N-glycosylation entre les vers femelles et mâles, un seul N-glycosite à la position 1897 NKT a été trouvé glycosylé dans les échantillons mâles. Les seuls orthologues de Bm14109 identifiés par la protéine NCBI Blast39 se trouvent dans le sous-ordre Spirurina75 des nématodes ou dans le Clade III des nématodes parasites34. Le tableau 3 montre la taxonomie de Brugia malayi telle qu'énumérée dans NCBI75. La présence de cette protéine à l'interface hôte parasite et dans un sous-ordre de nématodes principalement parasites indique que cette glycoprotéine pourrait avoir un rôle hautement spécialisé.

Bm10521, Bm10329 et Bm10905 sont des glycoprotéines supplémentaires avec des orthologues limités au sous-ordre des nématodes Spirurina. Ces glycoprotéines ne se trouvent pas dans nos échantillons de microfilaires mais sont présentes dans les vers adultes femelles et mâles. De plus, les données transcriptomiques montrent que les transcrits Bm10521 sont limités aux vers adultes et que les transcrits Bm10329 et Bm10905 sont plus répandus chez les vers adultes76,77. La protéine Bm10521 est supposée être dans la membrane mais n'est pas autrement caractérisée. Nos données montrent que chez les vers mâles, il est glycosylé à deux des huit N-glycosites canoniques à 479 NSS et 806 NDT, tandis que chez les vers femelles, il n'est glycosylé qu'à un seul N-glycosite différent à 749 NDS. Bm10329 est prédit comme une protéine extracellulaire par DeepLoc53. Dans des études de protéomique précédentes, il a été identifié dans des échantillons enrichis en membrane31 et dans l'étude de transcriptomique spatiale, il s'est avéré qu'il était enrichi dans l'intestin72. Le seul site canonique est N-glycosylé à 253 NVT chez les vers femelles et mâles. Ce site se trouve également aglycosylé chez les vers femelles. Enfin, Bm10905 est restreint non seulement au sous-ordre Spirurina mais à la famille des Onchocercidae. Il est prédit qu'il est extracellulaire par DeepLoc53 et autrement non caractérisé. Nos données montrent que sur 3 N-glycosites canoniques possibles, il est N-glycosylé sur 2 sites chez les vers femelles à 37 NTS et 93 NET et uniquement sur le site 37 chez les vers mâles. Alors que le manque d'homologie avec les protéines caractérisées rend difficile l'attribution d'une fonction à Bm14109, Bm10521, Bm10329 et Bm10905, ce statut indéterminé ainsi que leurs données de localisation cellulaire prédites et observées font de ces N-glycoprotéines des candidats attrayants pour une étude plus approfondie.

Des exemples restreints de nématodes de N-glycoprotéines dans le tableau 2 sont Bm3266 et Bm8085. Selon l'ontologie des gènes, Bm3266 devrait se lier aux lipides et DeepLoc53 devrait être une protéine extracellulaire. L'ARNi de son orthologue de C. elegans, F10D11.6, a montré des phénotypes létaux embryonnaires et létaux larvaires78. Bien que Bm3266 ait 5 N-glycosites canoniques, il est N-glycosylé à 817 NTT et 884 NAS chez les vers femelles et seulement à 884 chez les vers mâles. Il est également prévu que Bm8085 soit une protéine extracellulaire et possède un domaine de la famille de type transthyrétine (TTR). Récemment, les protéines avec ce domaine TTR ont été décrites comme des antigènes majeurs des infections filariennes humaines24. Bien que son orthologue chez C. elegans n'ait pas de phénotype ARNi, probablement en raison de la redondance, il s'est avéré important dans les interactions cellule à cellule. Spécifiquement pour C. elegans ttr-52, il agit comme une molécule pont qui médie l'apoptose79. Bm8085 est N-glycosylé au niveau de son unique N-glycosite canonique 29 NGT chez les vers femelles et mâles. Parce qu'ils n'ont pas d'orthologues proches dans le génome de l'hôte, Bm3266 et Bm8085 peuvent être des candidats intéressants pour une étude plus approfondie.

Bm3610 se trouve uniquement dans les vers mâles et femelles avec cinq des huit N-glycosites canoniques identifiés dans les vers femelles à 131 NIS, 227 NMT, 272 NGS, 394 NRT et 477 NIS et 3 N-glycosites identifiés dans les vers mâles à 131, 227 et 477. Il s'agit d'une protéine transmembranaire à passage unique prédite comme étant dans l'appareil de Golgi par l'ontologie des gènes, tandis que DeepLoc53 prédit qu'il s'agit d'une protéine/enzyme ER. La fonction moléculaire de l'ontologie génique prédit qu'elle fait partie de la famille des glycosyltransférases 14. Il s'agit d'une famille bien conservée mais diversifiée d'enzymes bêta-1,6-N-acétylglucosaminyltransférase qui peuvent convertir des N-acétyllactoseaminoglycanes linéaires en ramifiés ou former des branches de chaîne latérale cruciales dans O-glycanes. Des études protéomiques antérieures ne concordent pas avec l'emplacement prévu pour cette enzyme et ont trouvé Bm3610 dans le protéome ES29, le protéome de la paroi corporelle42, le protéome de surface et le protéome membranaire31. Les orthologues de C. elegans, F30A10.4, R07B7.6 et F35H8.2, sont d'autres glycosyltransférases, cette dernière étant annotée en tant que protéine membranaire de Golgi et N-glycosylée sur trois N-glycosites21. Notamment, les N-glycosites de ces orthologues de C. elegans et d'autres identifiés par BlastP39 ne se chevauchent pas avec les sites de N-glycosylation de Bm3610 et l'identité protéique entre ces orthologues de nématodes est inférieure à 40 %. Lors de la recherche d'orthologues humains utilisant BlastP39, nous trouvons des enzymes comme C2GnT380, une enzyme de ramification O-glycane de type mucine avec 30% d'identité protéique. Et comme pour les orthologues de C. elegans, il n'y a pas de chevauchement avec les sites de N-glycosylation C2GnT3. Cela indique la possibilité que même s'il appartient à la même famille de glycosyltransférases, Bm3610 peut jouer un rôle différent ou être actif sur un substrat différent, en particulier si cette enzyme est présente à la surface, comme l'indiquent les études protéomiques.

Les nématodes sont un groupe diversifié et important d'organismes qui ont été organisés en cinq clades. C. elegans et H. contortus appartiennent tous deux aux nématodes du Clade V tandis que B. malayi et d'autres nématodes filariens appartiennent à un groupe distinct de nématodes du Clade III34. Nous avons élargi nos découvertes en utilisant les N-glycoprotéomes de C. elegans et H. contortus pour rechercher des N-glycoprotéines communes et des N-glycoprotéines uniques à B. malayi. Nous avons d'abord recherché des orthologues des N-glycoprotéines identifiées de B. malayi dans ces deux protéomes de nématodes54. Nous avons identifié des orthologues pour 425 des 582 N-glycoprotéines de B. malayi laissant 157 N-glycoprotéines filaires ou spécifiques de B. malayi qui n'ont pas d'orthologue identifié chez C. elegans ou H. contortus (tableau supplémentaire S6C. elegans et H. contortus orthologues, Fig. . 6). Sans surprise, comme C. elegans et H. contortus sont tous deux des nématodes du Clade V et étroitement liés l'un à l'autre, 361 N-glycoprotéines de B. malayi avaient des orthologues chez les deux espèces (Fig. 6 : encadré en gris). Seuls 31 orthologues de N-glycoprotéines de B. malayi étaient uniques à C. elegans (Fig. 6 : 2e et 4e barres) et 33 uniques à H. contortus (Fig. 6 : 3e et 5e barres). Nous avons ensuite vérifié si les orthologues de C. elegans ou de H. contortus étaient présents dans leurs N-glycoprotéomes respectifs21,32,35. Alors que 31 N-glycoprotéines de B. malayi ont à la fois des orthologues de C. elegans et de H. contortus qui ont également été identifiés comme N-glycoprotéines, 119 N-glycoprotéines de B. malayi ont des orthologues de C. elegans qui sont également des N-glycoprotéines et 71 B. Les N-glycoprotéines malayi ont des orthologues de H. contortus qui sont également des N-glycoprotéines. Cet ensemble partagé de N-glycoprotéines entre B. malayi, C. elegans et H. contortus peut être exploré plus avant pour identifier des protéines importantes qui sont uniques au cycle de vie du nématode et qui sont uniques ou différentes de l'hôte mammifère. Nous nous attendons à ce que certaines de ces N-glycoprotéines orthologues aient des N-glycosites qui sont alignés ou sont conservés et d'autres qui différeront comme trouvé pour les antigènes ES-62 et H11 mentionnés précédemment. Nous avons exploré cela plus en profondeur en utilisant un alignement multiple55 d'une N-glycoprotéine bien conservée, l'intégrine bêta, qui est présente dans les trois N-glycoprotéomes de nématodes (Fig. S2 supplémentaire). L'intégrine bêta Bm7611 a sept N-glycosites identifiés sur huit possibles N-glycosites canoniques à 54 NYT, 276 NNS, 407 NAS, 537 NES, 679 NET, 700 NDT et 728 NLT avec trois sites glycosylés dans les trois échantillons, un site unique aux échantillons de mâles et 2 sites uniques aux échantillons de microfilaires. Dans l'orthologue de l'intégrine bêta de C. elegans (72 % d'identité), huit N-glycosites ont été identifiés, dont cinq N-glycosites d'alignement à 54, 276, 407, 537, 679 et 700 ainsi qu'un N-glycosite différent à 143 NVT qui n'est pas un N-glycosite canonique chez B. malayi mais qui est partagé dans la séquence H. contortus. Un deuxième site identifié est unique à C. elegans à 400 NAS et n'est pas présent dans les deux autres orthologues. L'orthologue bêta de l'intégrine de H. contortus (72 % d'identité) a deux N-glycosites identifiés à 407 et 537. Il n'a pas de N-glycosites canoniques qui s'alignent avec 276 ou 679 mais s'alignent avec les N-glycosites de B. malayi restants identifiés ce qui pourrait suggérer que ces sites sont N-glycosylés à d'autres stades du cycle de vie du nématode H. contortus. Ainsi, les différences observées au niveau des N-glycosites alignés ou conservés mettent en évidence la possibilité d'une variation de l'occupation des N-glycosites en fonction de l'expression tissulaire ou des stades de la vie. De plus, les 157 N-glycoprotéines sans orthologues constituent un ensemble prometteur de protéines à explorer car elles sont peut-être des N-glycoprotéines filaires ou spécifiques de B. malayi.

Analyse des données UpSetR des orthologues des N-glycoprotéines de B. malayi chez C. elegans et H. contortus : HCON_N-glycoprotéine indique tous les orthologues de H. contortus qui ont été identifiés comme N-glycoprotéines. HCON_ortholog indique les orthologues restants de H. contortus qui n'ont pas été identifiés comme N-glycoprotéines. CELE_N-glycoprotéine indique tous les orthologues de C. elegans qui ont été identifiés comme N-glycoprotéines. CELE_ortholog indique les orthologues restants de C. elegans qui n'ont pas été identifiés comme N-glycoprotéines. Aucun orthologue n'indique qu'il n'y avait pas d'orthologues identifiés chez C. elegans ou H. contortus. La taille de l'ensemble indiquée à gauche indique le nombre de protéines dans chaque ensemble. Les barres qui sont au-dessus des points simples montrent le nombre de protéines N-glycosylées uniques à cet ensemble de protéines. Les barres qui sont au-dessus de plusieurs points joints montrent le nombre de protéines N-glycosylées en commun avec ces ensembles de protéines. La boîte grise montre les N-glycoprotéines de B. malayi qui avaient des orthologues dans les deux espèces.

Avec d'autres N-glycoprotéomes de nématodes et des N-glycoprotéines individuelles de B. malayi, cette cartographie de 1273 N-glycosites de B. malayi dans 582 N-glycoprotéines de vers mâles adultes, de vers femelles adultes et de microfilaires ajoute encore aux données protéomiques et à notre compréhension actuelle de la N-glycosylation de ce parasite filarien. La cartographie N-glycosite à partir de l'enrichissement Fbs1 de N-glycopeptides a produit des ensembles de données hautement enrichis en augmentant à la fois le nombre et la proportion de N-glycosites identifiés tout en diminuant le bruit de fond des peptides N + 3 sans motifs N-glycosite canoniques. L'ontologie des gènes et la prédiction de la localisation cellulaire ont montré que le N-glycoprotéome était enrichi en protéines membranaires et extracellulaires. Nous avons montré que cet ensemble de N-glycoprotéines peut être extrait de différentes manières. La caractérisation de l'occupation du N-glycosite des protéines individuelles, comme indiqué pour les protéines hautement glycosylées répertoriées dans le tableau 1 et illustrées pour Bm7191 dans la figure 3, a montré des variations qui pourraient indiquer des différences biologiques et doivent être explorées plus avant pour déterminer sa signification. De même, l'exploration de la N-glycosylation des protéines cuticulaires et immunomodulatrices précédemment identifiées dans ces trois stades hôtes a confirmé la variation de l'occupation du N-glycosite présente dans ces protéines biologiquement importantes. L'étude de groupes de protéines comme l'ensemble restreint de vers adultes et leur relation avec la biologie du parasite a conduit à l'identification de N-glycoprotéines spécifiques du parasite et du nématode à l'interface hôte. Ces N-glycoprotéines identifiées sans orthologues hôtes sont des candidats thérapeutiques ou biomarqueurs prometteurs. Dans le prolongement de ce travail, nous prévoyons de caractériser les peptides enrichis en Fbs1 sans clivage PNGase F pour étudier les N-glycopeptides intacts et corréler les structures glycanes avec des glycosites spécifiques81. En plus de confirmer notre étude de cartographie et d'occupation des N-glycosites, la caractérisation des structures des N-glycanes et de leur hétérogénéité sur chaque site pour les vers mâles, les vers femelles et les microfilaires permettra de mieux comprendre la N-glycosylation des protéines des parasites filariens.

Les données de protéomique de spectrométrie de masse ont été déposées auprès du Consortium ProteomeXchange via le référentiel partenaire PRIDE38 avec l'identifiant de jeu de données PXD039002 et 10.6019/PXD039002.

Fiche d'information sur la filariose lymphatique, Organisation mondiale de la santé, Fiche d'information http://www.who.int/en/news-room/fact-sheets/detail/lymphatic-filariasis, (2021).

Taylor, MJ, Hoerauf, A. & Bockarie, M. Filariose lymphatique et onchocercose. Lancette 376, 1175–1185. https://doi.org/10.1016/S0140-6736(10)60586-7 (2010).

Article PubMed Google Scholar

Molyneux, DH Progresser vers l'élimination de la filariose lymphatique. N. Engl. J. Med. 379, 1871–1872. https://doi.org/10.1056/NEJMe1811455 (2018).

Article PubMed Google Scholar

King, CL et al. Un essai d'un traitement à trois médicaments pour la filariose lymphatique. N. Engl. J. Med. 379, 1801–1810. https://doi.org/10.1056/NEJMoa1706854 (2018).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Osei-Atweneboana, MY et al. Preuve phénotypique de la résistance émergente à l'ivermectine chez Onchocerca volvulus. PLoS Négl. Trop. Dis. 5, e998–e998. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0000998 (2011).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Schwab, AE, Boakye, DA, Kyelem, D. & Prichard, RK Détection de mutations associées à la résistance au benzimidazole chez le nématode filarien Wuchereria bancrofti et preuves de la sélection par un traitement combiné à l'albendazole et à l'ivermectine. Suis. J. Trop. Méd. Hyg. 73, 234–238. https://doi.org/10.4269/ajtmh.2005.73.234 (2005).

Article CAS PubMed Google Scholar

Hoerauf, A., Satoguina, J., Saeftel, M. & Specht, S. Immunomodulation par les nématodes filariens. Immunol antiparasitaire. 27, 417–429. https://doi.org/10.1111/j.1365-3024.2005.00792.x (2005).

Article CAS PubMed Google Scholar

Grabitzki, J. & Lochnit, G. Immunomodulation par la phosphocholine - Biosynthèse, structures et implications immunologiques des épitopes PC parasites. Mol. Immunol. 47, 149–163. https://doi.org/10.1016/j.molimm.2009.09.035 (2009).

Article CAS PubMed Google Scholar

Ahmed, Royaume-Uni et al. La phosphorylcholine liée aux glucides du nématode parasite produit ES-62 module l'activation du complément. J. Biol. Chim. 291, 11939-11953. https://doi.org/10.1074/jbc.M115.702746 (2016).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

van Die, I. & Cummings, RD Gimmickry glycane par les helminthes parasites : une stratégie pour moduler la réponse immunitaire de l'hôte ?. Glycobiologie 20, 2–12. https://doi.org/10.1093/glycob/cwp140 (2010).

Article CAS PubMed Google Scholar

Bhoj, P., Togre, N., Khatri, V. & Goswami, K. Exploiter la stratégie d'évasion immunitaire des filaires lymphatiques : une approche thérapeutique contre la pathologie inflammatoire et infectieuse. Vaccins (Bâle) https://doi.org/10.3390/vaccines10081235 (2022).

Article PubMed Google Scholar

Weil, GJ et al. Un dosage immunoenzymatique à base d'anticorps monoclonaux pour la détection de l'antigénémie parasitaire dans la filariose bancroftienne. J. Infecter. Dis. 156, 350–355. https://doi.org/10.1093/infdis/156.2.350 (1987).

Article CAS PubMed Google Scholar

Hertz, MI et al. Caractérisation des déterminants glycanes qui interviennent dans la reconnaissance de l'antigène circulant majeur de Wuchereria bancrofti par des anticorps diagnostiques. Mol. Biochimie. Parasitol. 240, 111317. https://doi.org/10.1016/j.molbiopara.2020.111317 (2020).

Article CAS PubMed Google Scholar

Helenius, A. & Aebi, AM Fonctions intracellulaires des glycanes N-liés. Sciences 291, 2364–2369. https://doi.org/10.1126/science.291.5512.2364 (2001).

Article ADS CAS PubMed Google Scholar

Miller, NL, Clark, T., Raman, R. & Sasisekharan, R. Glycans dans les interactions virus-hôte : une perspective structurelle. Devant. Mol. Biosci. 8, 505 (2021).

Article Google Scholar

Tate, MD et al. Jouer à cache-cache : comment la glycosylation de l'hémagglutinine du virus de la grippe peut moduler la réponse immunitaire à l'infection. Virus https://doi.org/10.3390/v6031294 (2014).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Mascola, JR & Montefiori, DC VIH-1 : le maître du déguisement de la nature. Nat. Méd. 9, 393–394. https://doi.org/10.1038/nm0403-393 (2003).

Article CAS PubMed Google Scholar

Casalino, L. et al. Au-delà du blindage : les rôles des glycanes dans la protéine de pointe du SRAS-CoV-2. ACS Cent. Sci. 6, 1722–1734. https://doi.org/10.1021/acscentsci.0c01056 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nord, SJ et al. Caractérisation glycoprotéomique spécifique au site de ES-62 : le principal produit sécrété du ver parasite Acanthocheilonema viteae. Glycobiologie 29, 562–571. https://doi.org/10.1093/glycob/cwz035 (2019).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Colley, KJ, Varki, A. & Kinoshita, T. dans Essentials of Glycobiology (eds rd et al.) 41–49. https://doi.org/10.1101/glycobiology.3e.004 (2015).

Zielinska, DF, Gnad, F., Schropp, K., Wiśniewski, JR & Mann, M. La cartographie des sites de N-glycosylation sur sept espèces évolutivement éloignées révèle un protéome de substrat divergent malgré une machinerie centrale commune. Mol. Cellule 46, 542–548. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2012.04.031 (2012).

Article CAS PubMed Google Scholar

Tweedie, S. et al. Brugia pahangi et Brugia malayi : une glycoprotéine associée à la surface (gp15/400) est composée de plusieurs unités répétées en tandem et traitée à partir d'un précurseur de 400 kDa. Exp. Parasitol. 76, 156–164. https://doi.org/10.1006/expr.1993.1018 (1993).

Article CAS PubMed Google Scholar

Kennedy, MW, Allen, JE, Wright, AS, McCruden, AB et Cooper, A. L'antigène polyprotéique gp15/400 de Brugia malayi se lie aux acides gras et aux rétinoïdes. Mol. Biochimie. Parasitol. 71, 41–50. https://doi.org/10.1016/0166-6851(95)00028-y (1995).

Article CAS PubMed Google Scholar

Hadadianpour, A. et al. Les AcM IgE humains identifient les principaux antigènes de l'infection par les vers parasites. J. Allergy Clin. Immunol. 150, 1525-1533. https://doi.org/10.1016/j.jaci.2022.05.022 (2022).

Article CAS PubMed Google Scholar

Page, AP, Stepek, G., Winter, AD & Pertab, D. Enzymologie de la cuticule du nématode : une cible médicamenteuse potentielle ?. Int. J. Parasitol. Médicaments Résistance aux médicaments. 4, 133–141. https://doi.org/10.1016/j.ijpddr.2014.05.003 (2014).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Haslam, SM et al. Études structurales des N-glycanes des parasites filaires : conservation des glycanes substitués par la phosphorylcholine parmi les espèces et découverte de nouveaux chito-oligomères. J. Biol. Chim. 274, 20953–20960. https://doi.org/10.1074/jbc.274.30.20953 (1999).

Article CAS PubMed Google Scholar

Pineda, MA, Lumb, F., Harnett, MM & Harnett, W. ES-62, un agent anti-inflammatoire thérapeutique développé par le nématode filarien Acanthocheilonema viteae. Mol. Biochimie. Parasitol. 194, 1–8. https://doi.org/10.1016/j.molbiopara.2014.03.003 (2014).

Article CAS PubMed Google Scholar

Bennuru, S. et al. Brugia malayi protéines excrétées/sécrétées à l'interface hôte/parasite : profilage protéomique spécifique au stade et au sexe. PLoS Négl. Trop. Dis. 3, e410. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0000410 (2009).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Moreno, Y. & Geary, TG Analyse protéomique spécifique au stade et au sexe des produits excréteurs-sécrétoires de Brugia malayi. PLOS Négl. Trop. Dis. 2, e326. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0000326 (2008).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Harischandra, H., Yuan, W., Loghry, HJ, Zamanian, M. & Kimber, MJ Le profilage de la libération de vésicules extracellulaires par le nématode filarien Brugia malayi révèle des différences de cargaison spécifiques au sexe et une sensibilité à l'ivermectine. PLoS Négl. Trop. Dis. 12, e0006438. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0006438 (2018).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mersha, FB et al. Analyse informatique et expérimentale du protéome ancré au glycophosphatidylinositol du nématode parasite humain Brugia malayi. PLoS One 14, e0216849. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0216849 (2019).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kaji, H. et al. La protéomique révèle la diversité des glycoprotéines liées à l'azote chez Caenorhabditis elegans et suggère un mécanisme de translocation atypique pour les protéines membranaires intégrales. Mol Cell Proteomics 6, 2100–2109. https://doi.org/10.1074/mcp.M600392-MCP200 (2007).

Article CAS PubMed Google Scholar

Corsi, AK, Wightman, B. & Chalfie, M. Une fenêtre transparente sur la biologie : Une amorce sur Caenorhabditis elegans, Wormbook (2015).

Blaxter, ML et al. Un cadre évolutif moléculaire pour le phylum Nematoda. Nature 392, 71–75. https://doi.org/10.1038/32160 (1998).

Article ADS CAS PubMed Google Scholar

Wang, C. et al. N-glycome et N-glycoprotéome d'un nématode parasite hématophage Haemonchus. Calcul. Structure. Biotechnol. J. 19, 2486–2496. https://doi.org/10.1016/j.csbj.2021.04.038 (2021).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wiśniewski, JR, Zougman, A., Nagaraj, N. & Mann, M. Méthode universelle de préparation d'échantillons pour l'analyse du protéome. Nat. Méthodes 6, 359–362. https://doi.org/10.1038/nmeth.1322 (2009).

Article CAS PubMed Google Scholar

Chen, M. et al. Une protéine de liaison aux glucides Fbs1 à haute affinité conçue pour la capture sélective des N-glycanes et des N-glycopeptides. Nat. Commun. 8, 15487–15487. https://doi.org/10.1038/ncomms15487 (2017).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dubaj Price, M. & Hurd, DD WormBase : Une base de données d'organismes modèles. Méd. Réf. Servir. Q.38, 70–80. https://doi.org/10.1080/02763869.2019.1548896 (2019).

Article PubMed Google Scholar

Coordonnateurs des ressources du NCBI. Ressources de la base de données du Centre national d'information sur les biotechnologies. Nucleic Acids Res. 46, D8–D13. https://doi.org/10.1093/nar/gkx1095 (2018).

Article CAS Google Scholar

Perez-Riverol, Y. et al. Les ressources de la base de données PRIDE en 2022 : une plaque tournante pour les preuves protéomiques basées sur la spectrométrie de masse. Nucleic Acids Res. 50, D543-d552. https://doi.org/10.1093/nar/gkab1038 (2022).

Article CAS PubMed Google Scholar

Bern, M., Kil, YJ & Becker, C. Byonic : Logiciel avancé d'identification de peptides et de protéines. Courant. Protocole Bioinformer. 13, 13–20. https://doi.org/10.1002/0471250953.bi1320s40 (2012).

Article Google Scholar

Morris, CP et al. Une analyse protéomique de la paroi corporelle, du tube digestif et de l'appareil reproducteur de Brugia malayi. PLoS Négl. Trop. Dis. 9, e0004054. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0004054 (2015).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bennuru, S. et al. Schémas d'expression protéomique spécifiques au stade du parasite filarien humain Brugia malayi et de son endosymbionte Wolbachia. Proc. Natl. Acad. Sci. 108, 9649 (2011).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Le consortium UniProt. UniProt : la base de connaissances universelle sur les protéines. Nucleic Acids Res. 45, D158–D169. https://doi.org/10.1093/nar/gkw1099 (2017).

Article CAS Google Scholar

Kanehisa, M., Furumichi, M., Sato, Y., Kawashima, M. & Ishiguro-Watanabe, M. KEGG pour l'analyse taxonomique des voies et des génomes. Acides nucléiques Res 51, D587-d592. https://doi.org/10.1093/nar/gkac963 (2023).

Article PubMed Google Scholar

Gupta, R. & Brunak, S. Prédiction de la glycosylation à travers le protéome humain et corrélation avec la fonction protéique. Pac. Symp. Bioinformatique., 310–322. http://psb.stanford.edu/psb-online/proceedings/psb02/gupta.pdf (2002).

Crooks, GE, Hon, G., Chandonia, JM & Brenner, SE WebLogo : Un générateur de logo de séquence. Génome Res. 14, 1188–1190. https://doi.org/10.1101/gr.849004 (2004).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hulsen, T., de Vlieg, J. & Alkema, W. BioVenn - Une application Web pour la comparaison et la visualisation de listes biologiques à l'aide de diagrammes de Venn proportionnels à la surface. BMC Genomics 9, 488. https://doi.org/10.1186/1471-2164-9-488 (2008).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Krogh, A., Larsson, B., von Heijne, G. & Sonnhammer, ELL Prédire la topologie des protéines transmembranaires avec un modèle de Markov caché : application aux génomes complets. J. Mol. Biol. 305, 567–580. https://doi.org/10.1006/jmbi.2000.4315 (2001).

Article CAS PubMed Google Scholar

Lex, A., Gehlenborg, N., Strobelt, H., Vuillemot, R. & Pfister, H. UpSet : Visualisation d'ensembles qui se croisent. IEEE Trans. Vis. Calcul. Gr. 20, 1983–1992. https://doi.org/10.1109/TVCG.2014.2346248 (2014).

Article Google Scholar

Raudvere, U. et al. g:Profiler : un serveur web pour l'analyse d'enrichissement fonctionnel et les conversions de listes de gènes (mise à jour 2019). Nucleic Acids Res. 47, W191–W198. https://doi.org/10.1093/nar/gkz369 (2019).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wickham, H. ggplot2 : Graphiques élégants pour l'analyse des données, (2016).

Almagro Armenteros, JJ, Sønderby, CK, Sønderby, SK, Nielsen, H. & Winther, O. DeepLoc : Prédiction de la localisation subcellulaire des protéines à l'aide de l'apprentissage en profondeur. Bioinformatique 33, 3387–3395. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btx431 (2017).

Article CAS PubMed Google Scholar

Howe, KL, Bolt, BJ, Shafie, M., Kersey, P. & Berriman, M. WormBase ParaSite—Une ressource complète pour la génomique des helminthes. Mol. Biochimie. Parasitol. 215, 2–10. https://doi.org/10.1016/j.molbiopara.2016.11.005 (2017).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sievers, F. et al. Génération rapide et évolutive d'alignements de séquences multiples de protéines de haute qualité à l'aide de Clustal Omega. Mol. Syst. Biol. 7, 539. https://doi.org/10.1038/msb.2011.75 (2011).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Maley, F., Trimble, RB, Tarentino, AL & Plummer, TH Caractérisation des glycoprotéines et de leurs oligosaccharides associés grâce à l'utilisation d'endoglycosidases. Anal. Biochimie. 180, 195–204. https://doi.org/10.1016/0003-2697(89)90115-2 (1989).

Article CAS PubMed Google Scholar

Kaji, H. et al. Capture d'affinité de lectine, marquage codé par isotope et spectrométrie de masse pour identifier les glycoprotéines liées à l'azote. Nat. Biotechnol. 21, 667–672. https://doi.org/10.1038/nbt829 (2003).

Article CAS PubMed Google Scholar

Petralia, LMC et al. La caractérisation basée sur la spectrométrie de masse et le microréseau de glycanes du glycome du nématode filarien Brugia malayi révèle des antigènes glycanes anioniques et zwitterioniques. Mol. Protéomique cellulaire 21, 100201. https://doi.org/10.1016/j.mcpro.2022.100201 (2022).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hokke, CH & van Diepen, A. Glycomique des helminthes—Répertoires de glycanes et interactions hôte-parasite. Mol. Biochimie. Parasitol. 215, 47–57. https://doi.org/10.1016/j.molbiopara.2016.12.001 (2017).

Article CAS PubMed Google Scholar

Krogh, A., Larsson, B., von Heijne, G. & Sonnhammer, EL Prédire la topologie des protéines transmembranaires avec un modèle de Markov caché : application aux génomes complets. J. Mol. Biol. 305, 567–580. https://doi.org/10.1006/jmbi.2000.4315 (2001).

Article CAS PubMed Google Scholar

Curran, SP & Ruvkun, G. Régulation de la durée de vie par des gènes conservés au cours de l'évolution essentiels à la viabilité. PLoS Genet. 3, e56. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.0030056 (2007).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Winter, AD, McCormack, G., Myllyharju, J. & Page, AP L'activité de la prolyl 4-hydroxlase est essentielle au développement et à la formation de cuticules chez le nématode parasite infectieux humain Brugia malayi. J. Biol. Chim. 288, 1750–1761. https://doi.org/10.1074/jbc.M112.397604 (2013).

Article CAS PubMed Google Scholar

Hill, KL, Harfe, BD, Dobbins, CA et L'Hernault, SW dpy-18 code une sous-unité alpha de la prolyl-4-hydroxylase chez Caenorhabditis elegans. Génétique 155, 1139–1148. https://doi.org/10.1093/genetics/155.3.1139 (2000).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Winter, AD & Page, AP La prolyl 4-hydroxylase est une enzyme essentielle de modification du procollagène nécessaire à la formation de l'exosquelette et au maintien de la forme corporelle chez le nématode Caenorhabditis elegans. Mol. Cell Biol. 20, 4084–4093. https://doi.org/10.1128/mcb.20.11.4084-4093.2000 (2000).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Thein, MC et al. L'activité combinée de réticulation de la matrice extracellulaire de la peroxydase MLT-7 et de la double oxydase BLI-3 est essentielle pour la viabilité post-embryonnaire chez Caenorhabditis elegans. J. Biol. Chim. 284, 17549–17563. https://doi.org/10.1074/jbc.M900831200 (2009).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ford, L. et al. Analyse fonctionnelle des gènes de protéase à cystéine de type cathepsine chez Brugia malayi adulte en utilisant l'interférence ARN. PLoS Négl. Trop. Dis. 3, e377–e377. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0000377 (2009).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hashmi, S., Zhang, J., Oksov, Y. & Lustigman, S. La Caenorhabditis elegans Cathepsin Z-like cysteine ​​protease, Ce-CPZ-1, a un rôle multifonctionnel au cours du développement des vers*. J. Biol. Chim. 279, 6035–6045. https://doi.org/10.1074/jbc.M312346200 (2004).

Article CAS PubMed Google Scholar

Lustigman, S., Zhang, J., Liu, J., Oksov, Y. & Hashmi, S. L'interférence ARN ciblant les protéases à cystéine de type cathepsine L et Z d'Onchocerca volvulus a confirmé leur fonction essentielle pendant la mue de L3. Mol. Biochimie. Parasitol. 138, 165–170. https://doi.org/10.1016/j.molbiopara.2004.08.003 (2004).

Article CAS PubMed Google Scholar

Pastrana, DV et al. Les parasites nématodes filariens sécrètent un homologue du facteur inhibiteur de la migration des cytokines macrophages humaines. Infecter. Immun. 66, 5955–5963. https://doi.org/10.1128/iai.66.12.5955-5963.1998 (1998).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zang, X., Yazdanbakhsh, M., Jiang, H., Kanost, MR et Maizels, RM Une nouvelle serpine exprimée par les microfilaires à diffusion hématogène du nématode parasite Brugia malayi inhibe les protéinases à sérine des neutrophiles humains. Sang 94, 1418–1428 (1999).

Article CAS PubMed Google Scholar

Darwiche, R. et al. Structure cristalline de la protéine-1 de type allergène de venin de Brugia malayi (BmVAL-1), un vaccin candidat contre la filariose lymphatique. Int. J. Parasitol. 48, 371–378. https://doi.org/10.1016/j.ijpara.2017.12.003 (2018).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Airs, PM et al. La transcriptomique spatiale révèle des cibles antiparasitaires associées à des comportements essentiels chez le parasite humain Brugia malayi. PLOS Pathog. 18, e1010399. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1010399 (2022).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Smith, TS, Munn, EA, Graham, M., Tavernor, AS & Greenwood, CA Purification et évaluation de la protéine membranaire intégrale H11 en tant qu'antigène protecteur contre Haemonchus contortus. Int. J. Parasitol. 23, 271–280. https://doi.org/10.1016/0020-7519(93)90150-W (1993).

Article CAS PubMed Google Scholar

Wang, C. et al. L'immunoprotection induite par H11 est principalement liée aux fractions N-glycanes lors d'une infection à Haemonchus contortus. Devant. Immunol. 13, https://doi.org/10.3389/fimmu.2022.1034820 (2022).

Schoch, CL et al. NCBI Taxonomy : une mise à jour complète sur la conservation, les ressources et les outils. Base de données (Oxford) 2020, doi : 10.1093/database/baaa062 (2020).

Choi, YJ et al. Une approche de séquençage en profondeur pour analyser de manière comparative le transcriptome des étapes du cycle de vie du ver filaire, Brugia malayi. PLoS Négl. Trop. Dis. 5, e1409. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0001409 (2011).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chung, M. et al. Ensemble de données transcriptomiques multi-espèces de Brugia malayi, de son Wolbachia Endosymbionte wBm et d'Aedes aegypti tout au long du cycle de vie de B. malayi. Microbiol. Resour. Annoncer. https://doi.org/10.1128/mra.01306-18 (2018).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Céron, J. et al. Les écrans ARNi à grande échelle identifient de nouveaux gènes qui interagissent avec la voie du rétinoblastome de C. elegans ainsi que des composants liés à l'épissage avec une activité synMuv B. BMC Dév. Biol. 7, 30–30. https://doi.org/10.1186/1471-213X-7-30 (2007).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang, X. et al. La protéine TTR-52 de type transthyrétine de Caenorhabditis elegans médie la reconnaissance des cellules apoptotiques par le récepteur des phagocytes CED-1. Nat. Cell Biol. 12, 655–664. https://doi.org/10.1038/ncb2068 (2010).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schwientek, T. et al. Contrôle de la formation de la branche O-glycane Clonage moléculaire et caractérisation d'une nouvelle core 2 beta1, 6-n-acétylglucosaminyltransférase associée au thymus. J. Biol. Chim. 275, 11106–11113. https://doi.org/10.1074/jbc.275.15.11106 (2000).

Article CAS PubMed Google Scholar

Chen, M. et al. L'analyse comparative du N-glycoprotéome spécifique au site révèle une N-glycosylation aberrante et donne un aperçu de la voie du mannose-6-phosphate dans le cancer. Commun. Biol. 6, 48. https://doi.org/10.1038/s42003-023-04439-4 (2023).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Télécharger les références

Nous remercions Clotilde S. Carlow, Thomas C. Evans Jr., Lindsey J. Cantin, Laudine MC Petralia et Douglas M. Oswald pour leurs commentaires critiques et la relecture du manuscrit. Nous remercions M. James Ellard et le Dr Salvatore V. Russello pour leur soutien continu à la recherche sur la glycobiologie des parasites.

FM, CM, CR, MC et JF ont reçu un financement et étaient employés par New England Biolabs au moment où ce travail a été effectué. CR est maintenant un employé de Moderna. Ces affiliations ne modifient pas notre adhésion à toutes les politiques de Scientific Reports sur le partage de données et de matériel.

New England Biolabs, Ipswich, MA, 01938, États-Unis

Fana B. Mersha, Colleen M. McClung, Minyong Chen, Cristian I. Ruse et Jeremy M. Foster

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

JF a conçu les expériences et supervisé le projet, FM a conçu et mené la ou les expériences avec le soutien de MC sur l'enrichissement en Fbs1 et CM et CR sur la spectrométrie de masse. FM a analysé les résultats, produit des graphiques et rédigé le manuscrit. Tous les auteurs ont contribué à la révision, à l'édition et à l'approbation du manuscrit final.

Correspondance à Fana B. Mersha ou Jeremy M. Foster.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

Libre accès Cet article est sous licence Creative Commons Attribution 4.0 International, qui permet l'utilisation, le partage, l'adaptation, la distribution et la reproduction sur n'importe quel support ou format, à condition que vous accordiez le crédit approprié à l'auteur ou aux auteurs originaux et à la source, fournir un lien vers la licence Creative Commons et indiquer si des modifications ont été apportées. Les images ou tout autre matériel de tiers dans cet article sont inclus dans la licence Creative Commons de l'article, sauf indication contraire dans une ligne de crédit au matériel. Si le matériel n'est pas inclus dans la licence Creative Commons de l'article et que votre utilisation prévue n'est pas autorisée par la réglementation légale ou dépasse l'utilisation autorisée, vous devrez obtenir l'autorisation directement du détenteur des droits d'auteur. Pour voir une copie de cette licence, visitez http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Réimpressions et autorisations

Mersha, FB, McClung, CM, Chen, M. et al. Définition du N-glycoprotéome filarien par cartographie des glycosites chez le nématode parasite humain Brugia malayi. Sci Rep 13, 7951 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-34936-9

Télécharger la citation

Reçu : 08 février 2023

Accepté : 10 mai 2023

Publié: 16 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-34936-9

Toute personne avec qui vous partagez le lien suivant pourra lire ce contenu :

Désolé, aucun lien partageable n'est actuellement disponible pour cet article.

Fourni par l'initiative de partage de contenu Springer Nature SharedIt

En soumettant un commentaire, vous acceptez de respecter nos conditions d'utilisation et nos directives communautaires. Si vous trouvez quelque chose d'abusif ou qui ne respecte pas nos conditions ou directives, veuillez le signaler comme inapproprié.