La cartographie des antigènes de norovirus humains pendant l'infection révèle l'étendue de la réponse immunitaire humorale

npj Vaccins volume 8, Numéro d'article : 87 (2023) Citer cet article

113 accès

2 Altmétrique

Détails des métriques

Les norovirus humains (HuNoV) sont la principale cause de gastro-entérite aiguë dans le monde. La réponse immunitaire humorale joue un rôle important dans l'élimination des infections à HuNoV et l'élucidation du paysage antigénique de HuNoV au cours d'une infection peut faire la lumière sur les cibles d'anticorps pour éclairer la conception de vaccins. Ici, nous avons utilisé la présentation de phages assistée par Jun-Fos d'une bibliothèque génomique HuNoV du génogroupe GI.1 et le séquençage en profondeur pour cartographier simultanément les épitopes des anticorps sériques de six individus infectés par GI.1 HuNoV. Nous avons trouvé des épitopes uniques et communs largement distribués parmi les protéines non structurelles et la principale protéine de capside. Les profils d'épitopes récurrents suggèrent des empreintes d'anticorps immunodominants chez ces individus. L'analyse des sérums prélevés longitudinalement sur trois individus a montré la présence d'épitopes existants dans les sérums de pré-infection, suggérant que ces individus avaient des infections antérieures par HuNoV. Néanmoins, des épitopes nouvellement reconnus sont apparus sept jours après l'infection. Ces nouveaux signaux épitopiques ont persisté 180 jours après l'infection avec les épitopes pré-infection, suggérant une production persistante d'anticorps reconnaissant les épitopes des infections précédentes et nouvelles. Enfin, l'analyse d'une bibliothèque de présentation de phages génomiques du génotype GII.4 avec les sérums de trois personnes infectées par le virus GII.4 a révélé des épitopes qui chevauchaient ceux identifiés dans les sélections d'affinité GI.1, suggérant la présence d'anticorps à réaction croisée GI.1/GII.4. Les résultats démontrent que la présentation de phages génomiques couplée à un séquençage profond peut caractériser les paysages antigéniques HuNoV à partir de sérums humains polyclonaux complexes pour révéler le moment et l'ampleur de la réponse immunitaire humorale humaine à l'infection.

Les norovirus humains (HuNoV) sont la principale cause de cas sporadiques et d'épidémies de gastro-entérite, causant environ 200 000 décès et représentant un fardeau économique mondial de 60 milliards de dollars chaque année1,2,3. Les norovirus (NoV) appartiennent à la famille des Caliciviridae et sont classés en 10 génogroupes (GI-GX) et 49 génotypes. Cinq génogroupes de NoV (I, II, IV, VIII et IX), qui contiennent 38 génotypes différents, sont capables d'infecter les humains4. La grande diversité de séquences des HuNoV conduit à une fuite immunitaire, créant un obstacle potentiel au développement d'un vaccin largement protecteur.

Le génome du NoV est un ARN monocaténaire de sens positif d'une longueur d'environ 7,5 kilobases (kb) et organisé en trois cadres de lecture ouverts (ORF). ORF1 code pour une grande polyprotéine transformée en six protéines non structurelles impliquées dans la réplication virale, notamment NS1/2 (p48), NS3 (nucléoside-triphosphatase ou NTPase), NS4 (p22), NS5 (VPg), NS6 (protéase) et NS7 (ARN polymérase dépendante de l'ARN ou RdRp). ORF2 et ORF3 codent respectivement pour les protéines de capside majeure (VP1) et mineure (VP2). La principale protéine de capside VP1 est composée d'un court bras N-terminal, d'un domaine de coquille (S) et d'un domaine saillant (P). Le domaine S maintient l'intégrité de l'assemblage de capside NoV. Le domaine P se lie directement aux antigènes du groupe histo-sanguin (HBGA) pour infecter les cellules humaines5,6. Le domaine P est en outre divisé en sous-domaines P1 et P2 où le sous-domaine P2 est exposé sur la surface externe et sa séquence est très variable, facilitant la fuite d'une réponse d'anticorps7. La protéine de capside mineure VP2 se lie à un motif conservé dans le domaine S de VP1. Sa fonction reste incertaine, bien qu'elle interagisse avec l'ARN génomique viral dans le NoV8 murin.

La réponse immunitaire humorale contre les infections par HuNoV joue un rôle essentiel dans la clairance virale et la protection contre les infections ultérieures6. Les preuves suggèrent que l'immunité humorale est plus efficace et plus durable que l'immunité des lymphocytes T dans l'élimination des infections à HuNoV9. De nombreux épitopes d'anticorps monoclonaux (mAb) pour HuNoV ont été identifiés. Une revue récente a résumé plus de 70 études publiées décrivant les épitopes linéaires et conformationnels, résidant principalement dans VP1, pour 307 mAbs9 uniques. Bien que la cartographie des épitopes dans les mAb soit essentielle pour la conception rationnelle d'un vaccin, elle ne peut pas capturer l'intégralité de la réponse immunitaire humorale polyclonale. Pour acquérir une compréhension globale de l'immunité humorale contre les infections à norovirus, l'identification des épitopes dans les sérums humains polyclonaux est nécessaire. Des travaux antérieurs ont évalué des sérums humains polyclonaux provenant à la fois d'individus infectés par HuNoV et de participants à des essais de vaccins et ont déterminé la présence d'une immunité protectrice et d'anticorps de blocage à réaction croisée dans ces deux cohortes10,11,12,13,14,15. Les anticorps sériques bloquant l'HBGA augmentent après une provocation par HuNoV et des infections naturelles10,11,12,14. Une autre étude a examiné le répertoire sérologique des sérums pré- et post-immunisés de trois participants à un essai de vaccin bivalent et a identifié un anticorps neutralisant largement protecteur et son épitope à réaction croisée15. Néanmoins, le paysage antigénique complet du HuNoV reste incomplet. Une carte complète des épitopes HuNoV fournirait une vue systématique de la réponse immunitaire humorale lors de l'infection par HuNoV. De telles cartes pourraient répondre à des questions telles que quels épitopes sont reconnus lors d'une infection par HuNoV, si le paysage antigénique de HuNoV diffère d'une personne à l'autre, si le paysage change à mesure que l'infection progresse et s'il existe des épitopes conservés et immunodominants parmi les HuNoV.

Le phage display consiste à présenter des peptides ou des protéines à la surface de la capside du bactériophage16. Les peptides ou protéines affichés sont codés dans le génome de chaque particule de phage. Ainsi, de grandes bibliothèques de peptides peuvent être criblées pour la liaison aux protéines cibles par sélection d'affinité et séquençage d'ADN17,18,19,20,21. En cartographiant les épitopes des anticorps provoqués par l'infection, le phage display couplé au séquençage de nouvelle génération (NGS) peut fournir une vue à haute résolution du paysage épitopique pendant la réponse immunitaire humorale. Récemment, des technologies telles que VirScan, qui utilise une bibliothèque de peptides de 206 espèces de virus affichés sur une plate-forme de phage T7 couplée à NGS, ainsi qu'une bibliothèque de présentation de phage pan-coronavirus ont été utilisées pour profiler les réponses immunitaires dans les sérums de patients COVID afin d'étudier les réponses immunitaires contre le SRAS-CoV-222,23,24.

Nous avons précédemment effectué des sélections d'affinité d'affichage de phage d'une bibliothèque d'affichage de phage génomique HuNoV couplée à un séquençage en profondeur pour identifier les épitopes d'un anticorps scFv et de sérums polyclonaux de lapin contre HuNoV25 (Fig. S1). Dans cette nouvelle étude, nous avons cherché à caractériser le répertoire de la réponse immunitaire humorale contre les infections à HuNoV en réalisant des sélections d'affinité couplées à un séquençage profond sur des sérums humains d'individus infectés par des HuNoV. À l'aide de notre bibliothèque de présentation de phages génomiques GI.1 Norwalk et d'une bibliothèque de présentation de phages génomiques GII.4 HOV nouvellement construite, nous avons profilé neuf sérums humains polyclonaux à un moment donné après l'infection. De plus, nous avons réalisé une étude longitudinale sur les sérums de trois personnes à la fois avant l'infection et à plusieurs moments après l'infection. Nous avons identifié des épitopes dans les protéines non structurales NS1/2 (p48), NS3 (NTPase), NS4 (p22), NS5 (VPg), NS6 (protéase) et NS7 (RdRp) ainsi que des épitopes à réaction croisée dans la protéine de capside majeure VP1 unique à GI.1 Norwalk ou GII.4 HOV. Nous avons observé que les paysages antigéniques varient d'un individu à l'autre, mais contiennent également des épitopes récurrents communs. Nous avons également déterminé les changements dans les profils d'épitopes chez les individus au cours d'une infection. Ces études ont révélé la présence d'épitopes dans les sérums de pré-infection, indiquant que les individus avaient des infections antérieures par HuNoV. De nouveaux épitopes sont apparus dans les protéines non structurales et structurales 7 à 30 jours après l'infection. La plupart de ces épitopes, ainsi que les épitopes détectés dans les sérums de pré-infection, ont persisté 180 jours après l'infection. Enfin, nous avons détecté des épitopes communs à GI.1 Norwalk et GII.4 HOV, confirmant la présence d'anticorps à réaction croisée entre génogroupes. Nos résultats montrent que le phage display couplé à un séquençage profond peut caractériser avec succès les épitopes dans des sérums humains polyclonaux complexes, fournissant une compréhension plus approfondie de la réponse immunitaire HuNoV, ce qui peut aider au développement de méthodes de dépistage des infections HuNoV et d'un vaccin largement protecteur.

Auparavant, nous avons construit une bibliothèque de présentation de phages génomiques cisaillés GI.1 et l'avons utilisée pour cartographier l'épitope d'un anticorps scFV humain25 (Fig. S1). La bibliothèque a également été utilisée pour cartographier simultanément plusieurs épitopes d'antisérums polyclonaux de lapin dirigés contre les particules de type viral (VLP) GI.125. Plus de 450 000 clones ont été regroupés pour créer cette bibliothèque génomique GI.1, dont la NGS a montré qu'elle était très diversifiée avec des inserts affichant une excellente couverture des cadres de lecture ouverts GI.125.

Dans cette étude, nous avons de nouveau utilisé la bibliothèque GI.1 pour cartographier le paysage antigénique de l'infection par HuNoV. Nous avons vérifié la diversité des inserts dans la bibliothèque en répétant NGS de la région d'insert de la bibliothèque naïve, confirmant la grande diversité de la bibliothèque (Fig. 1a, b). Le clonage de l'ADN cisaillé dans le plasmide de présentation de phage a pour résultat des inserts dans l'orientation directe ou inverse par rapport au génome GI.1. Notez que seuls les inserts d'orientation vers l'avant coderont les peptides HuNoV dans le cadre. Nous avons compté un total de sept millions d'inserts de brin avant et de neuf millions d'inserts de brin inverse présents dans la bibliothèque. Les inserts ont été alignés sur le génome de référence pour obtenir un score de couverture par nucléotide26,27. Le score de couverture a été calculé comme le nombre d'occurrences de chaque position de nucléotide dans le pool d'inserts directs et inverses alignés sur le génome de référence (Fig. 1c)28. Les résultats ont montré que pour les brins avant et arrière, plusieurs inserts sont présents pour chaque position de nucléotide dans le plasmide contenant le génome HuNoV, indiquant en outre une excellente couverture du génome par des inserts (Fig. 1c). La distribution de taille des inserts a également été calculée, montrant que les inserts codent pour des peptides allant de 10 à 170 acides aminés de longueur, l'insert moyen codant pour 47 acides aminés (Fig. 1d). La large gamme de longueurs de peptides ainsi que leur distribution continue suggèrent que les épitopes linéaires et conformationnels sont codés par des inserts dans la bibliothèque.

a Distribution des inserts de brin avant (rouge) dans la bibliothèque naïve cartographiée sur leurs positions dans le plasmide pKS-NV68 KM. La position de l'extrémité 5' de l'insert dans le plasmide pKS-NV68 KM est représentée en abscisse, tandis que la position de l'extrémité 3' de l'insert est désignée en ordonnée. Le nombre d'occurrences de l'insertion est défini en nombre sur l'axe z. b Répartition des inserts à brin inverse (noir) dans la bibliothèque naïve. c Couverture de la bibliothèque naïve définie par des alignements de séquences d'ADN. Un total de 7 498 441 inserts de brin avant et 9 481 435 inserts de brin inverse ont été alignés pour générer un score de couverture par position de nucléotide. Le score de couverture a été défini comme le nombre d'occurrences de chaque position de nucléotide dans l'ensemble de fragments d'insert d'ADN alignés pour les inserts de brin avant et les inserts de brin inverse, respectivement. Les scores de couverture pour les inserts de brin avant de pKS-NV68 KM (rouge) sont indiqués au-dessus de l'axe des x, tandis que les scores de couverture pour les inserts de brin inverse (gris) sont indiqués sous l'axe des x. d Distribution de la taille des peptides dans la bibliothèque naïve. La fréquence de chaque peptide unique est indiquée sur l'axe y tandis que la taille du peptide est indiquée sur l'axe x.

Pour profiler la réponse des anticorps contre les HuNoV au cours de l'infection, des échantillons de sérum de personnes infectées par GI.1 ont été utilisés pour la sélection par affinité de la bibliothèque de présentation de phages génomiques GI.1. Nous avons examiné les sérums de six personnes infectées par GI.1 HuNoV. Ces sérums ont été collectés dans le cadre d'une étude précédente29,30. Des sélections d'affinité ont été effectuées sur des sérums de quatre personnes à 14 jours après l'infection et de deux personnes à 30 jours après l'infection. Les sélections d'affinité ont été effectuées en immobilisant d'abord les anticorps dans les sérums en utilisant des billes magnétiques de protéine A/G. La banque de phages naïfs a été ajoutée aux anticorps immobilisés pour permettre la liaison. Après deux cycles de sélection par affinité, les phages liés ont été élués et la région d'insertion a été amplifiée par PCR. Un séquençage en profondeur a été effectué sur les produits de PCR pour évaluer la distribution des inserts lorsqu'ils sont alignés sur la séquence plasmidique qui comprend les ORF HuNoV (Fig. 1). Les résultats pour l'individu 715 sont présentés à la Fig. 2 et les résultats pour les six individus sont à la Fig. S2.

L'axe des abscisses désigne l'extrémité 5' des inserts, l'axe des ordonnées l'extrémité 3' des inserts et l'axe des z le nombre d'occurrences. La distribution des clusters d'inserts définit les épitopes anti-GI.1 dans a NS1/2 (p48), b NS3 (NTPase), c NS4 (p22), d NS5 (VPg), e NS6 (protéase) et f NS7 (RdRp).

Les épitopes ont été identifiés à partir des données de séquençage en profondeur sur la base de la distribution des inserts exprimés en nombres de comptage cartographiés sur le génome HuNoV avec la prémisse que les nombres de comptage sont proportionnels à l'étendue de l'enrichissement en anticorps dans les sérums25,27. La distribution des inserts et les scores de couverture associés après deux cycles de sélection par affinité avec les sérums des individus infectés ont montré une large gamme de signaux représentant des épitopes situés dans la protéine de capside VP1 ainsi que dans plusieurs protéines non structurelles (Fig. S2).

La bibliothèque de présentation de phage génomique a été construite en ligaturant de l'ADN génomique cisaillé de manière aléatoire dans le plasmide de présentation de phage. Étant donné que les inserts génomiques peuvent être dans l'une ou l'autre orientation (avant ou arrière) et dans l'un des trois cadres de lecture, la majorité des inserts de la bibliothèque naïve sont hors cadre et ne produiront pas de peptide HuNoV. Si la sélection par affinité enrichit les peptides HuNoV reconnus par les anticorps dans les sérums, la fréquence des inserts codant pour les peptides dans le cadre devrait augmenter avec les cycles de sélection ultérieurs, tandis que les inserts codant pour les séquences hors cadre devraient être éliminés. Comme le montre la figure S3a, environ 20 % des inserts de la bibliothèque naïve codent pour des peptides dans le cadre, comme prévu pour les inserts aléatoires, tandis qu'au deuxième tour de sélection, 70 à 90 % des inserts codent pour des peptides dans le cadre tandis que les inserts codant pour des séquences hors cadre ont été largement éliminés. Ces résultats indiquent que la sélection par affinité enrichie pour les séquences HuNoV qui lient les anticorps présents dans les sérums, c'est-à-dire les épitopes. Nous avons également analysé la fraction d'inserts dans le cadre pour chaque numéro de comptage. La figure S3b montre que la fraction des inserts dans le cadre de la bibliothèque naïve pour chaque groupe de nombre d'inserts est restée constante à 20 %, ce qui est identique à ce que nous avons observé pour la fraction totale des inserts dans le cadre. De plus, nous avons observé que la fréquence des insertions dans le cadre dans les bibliothèques après la sélection commence à augmenter avec des insertions au nombre de cinq. Cela suggère que les inserts dans le cadre qui ont un nombre de cinq ou plus codent pour des peptides enrichis par sélection d'affinité, c'est-à-dire des epitopes. Par conséquent, les inserts dans le cadre avec un nombre de cinq ou plus dans les bibliothèques après sélection ont été choisis pour calculer les scores de couverture par position de nucléotide, comme décrit ci-dessus pour la bibliothèque naïve.

Pour illustrer la profondeur du séquençage et la manière dont les séquences composant chaque épitope sont enrichies de manière répétée par les anticorps dans les sérums, la carte de couverture pour le participant à l'étude 715 est illustrée à titre d'exemple sur les Fig. 3 et S4. La carte de couverture indique que les épitopes dans ORF1 sont situés sous forme de séquences d'acides aminés dans le cadre dans NS1/2 (p48), NS3 (NTPase), NS4 (p22), NS5 (VPg), NS6 (protéase) et NS7 (ARN polymérase dépendante de l'ARN, ou RdRp). La carte de couverture indique également la présence d'épitopes dans la protéine de capside VP1 (non marquée sur les figures 3 et S4). Les épitopes révélés par les scores de couverture peuvent être résolus à une résolution plus élevée en alignant les séquences associées aux régions de scores de couverture élevés pour définir avec précision les épitopes à une résolution d'acide aminé unique (Fig. 3 et S4). Par exemple, l'alignement des séquences associées à NS4 a révélé un épitope de 100 acides aminés. Étant donné que les épitopes linéaires ont moins de 20 acides aminés de long31, l'épitope NS4 est probablement conformationnel (Fig. 3, S4, Tableau S1). Les alignements de séquences provenant de régions à score de couverture élevé de cet individu ont fourni de la même manière une définition haute résolution d'autres épitopes, comme le montrent la figure 3 et le tableau S1. Pris ensemble, ces résultats montrent que la sélection par affinité et l'approche de séquençage en profondeur peuvent identifier plusieurs épitopes simultanément et à haute résolution à partir d'un seul échantillon de sérum polyclonal.

La couverture des inserts après deux cycles de sélection par affinité avec des sérums du sujet 715 a été déterminée par alignement de la séquence d'ADN sur le plasmide contenant les ORF GI.1 et est montrée sur la gauche. Le score de couverture par nucléotide est indiqué sur l'axe y tandis que la position sur la séquence plasmidique est indiquée sur l'axe x. Les positions des ORF HuNoV 1 à 3 sont indiquées sous l'axe des x à titre de référence. Seuls les inserts du brin avant sont représentés. L'alignement des peptides enrichis en NS6 (protéase) est représenté sur la droite. La numérotation en haut de l'alignement indique les positions des résidus d'acides aminés dans les protéines non structurales. Le schéma de couleurs Jalview Zappo est utilisé, dans lequel les résidus aliphatiques/hydrophobes (I, L, V, A et M) sont pêche, les résidus aromatiques (F, W et Y) sont dorés, les résidus chargés positivement (K, R et H) sont bleus, les résidus chargés négativement (D et E) sont rouges, les résidus hydrophiles (S, T, N et Q) sont verts, les résidus conformationnels spéciaux (G et P) sont magenta et la cystéine est jaune. Les familles de peptides alignées de gauche à droite sur la carte de couverture définissent les épitopes anti-GI.1 dans NS1/2 (p48), NS3 (NTPase), NS4 (p22), NS5 (VPg), NS6 (protéase) et NS7 (RdRp).

Nous avons ensuite comparé la distribution des épitopes pour les anticorps induits par l'infection par HuNoV parmi les différents individus. Ceci a été accompli en comparant les cartes de score de couverture pour détecter les épitopes partagés et uniques parmi la cohorte de six individus. Les épitopes ont été en outre vérifiés en comparant la fraction des inserts dans le cadre dans une fenêtre qui contient un épitope potentiel à la fraction des inserts dans le cadre dans la bibliothèque naïve. Si la fréquence d'insertion dans le cadre des bibliothèques après sélection par affinité est supérieure à celle de la bibliothèque naïve dans une fenêtre donnée, la présence d'un épitope est confirmée (Fig. 4).

a La couverture des inserts dans la bibliothèque naïve (en haut) ainsi que des inserts après deux cycles de sélection par affinité avec les sérums des sujets 715, 720, 723, 731, 732 et 750 a été déterminée par alignement de la séquence d'ADN sur le plasmide contenant les ORF GI.1. Le score de couverture par nucléotide est indiqué sur l'axe y tandis que la position sur la séquence plasmidique est indiquée sur l'axe x. Les positions des ORF HuNoV 1 à 3 sont indiquées sous l'axe des x à titre de référence. Seuls les inserts du brin avant sont représentés. b La fraction d'inserts dans le cadre dans ORF2 dans la bibliothèque naïve par rapport aux inserts dans le cadre après deux cycles de sélection par affinité avec les sérums des sujets 715, 720, 723, 731, 732 et 750. Une fenêtre glissante de huit acides aminés le long de GI.1 ORF2 est indiquée sur l'axe des x tandis que la fraction des inserts dans le cadre de la bibliothèque naïve (barres noires) et des bibliothèques après deux cycles de sélection par affinité (barres rouges) sont affichées sur l'axe des ordonnées.

Nous avons identifié 13 épitopes dans les protéines non structurales. Il existe trois épitopes importants dans NS1/2 trouvés chez plusieurs individus. Les alignements indiquent que les épitopes correspondent aux positions d'acides aminés 131–190, 248–282 et 315–355 de l'ORF1, et ont été trouvés chez un, deux et un individu, respectivement (Figs. 4a, 5, Tableau S1). 3 autres épitopes importants se trouvent dans NS3, situés aux positions 406–448, 498–554, chacun trouvé chez un individu, et 697–743, trouvé chez deux individus. Le 7e épitope est long de 100 acides aminés et couvre les positions 759 à 858 de l'ORF1 dans le domaine N-terminal (NTD) de NS4. Comme indiqué, la longueur de cette séquence suggère qu'il s'agit d'un épitope conformationnel. Cet épitope a été trouvé chez cinq individus. Le 8e épitope se trouve dans NS5 aux positions 987–1037 et a été trouvé chez les six individus. Le 9ème épitope est dans NS6. Cet épitope, trouvé chez cinq individus, couvre 86 résidus des positions 1095 à 1180. Quatre épitopes ont été identifiés dans NS7 et sont situés aux positions 1311–1353, 1488–1539, 1577–1653 et 1709–1780 de ORF1 avec des longueurs de 43 , 52, 77 et 72 acides aminés, respectivement. Les deux premiers épitopes NS7 ont été trouvés chez deux individus tandis que le troisième épitope a été trouvé chez un individu, et le dernier épitope a été trouvé chez quatre individus (Figs. 4a, 5, Tableau S1). La longueur des séquences suggère qu'il s'agit d'épitopes conformationnels.

Le dendrogramme compare les profils d'épitopes partagés entre les six individus. Les blocs roses indiquent les épitopes pour chaque individu dans le domaine protéique non structurel ou structurel spécifié.

Pour identifier les épitopes dans VP1, nous avons divisé ORF2 en 67 fenêtres de 24 nucléotides, soit huit résidus d'acides aminés de long. Semblable à la façon dont nous avons défini les épitopes dans ORF1, nous avons comparé les fréquences des inserts dans le cadre dans les bibliothèques après sélection et dans la bibliothèque naïve. Si la fréquence des inserts dans le cadre des bibliothèques sélectionnées est supérieure à celle de la bibliothèque naïve dans une fenêtre 8-mer donnée, nous avons aligné les inserts dans la fenêtre pour identifier un épitope. Dans l'ensemble, nous avons identifié 35 épitopes dans VP1 dont 19 dans le domaine S, 12 dans le sous-domaine P1 et quatre dans le sous-domaine P2. Semblables aux épitopes que nous avons trouvés dans les protéines non structurelles, la plupart des épitopes VP1 étaient partagés entre plus de deux individus, cinq épitopes étant présents chez les six individus, ce qui suggère que ces épitopes sont hautement immunogènes (Figs. 4b, 5, Tableau S1).

Il existe 19 épitopes dans le domaine S, dont la longueur varie de 12 à 35 résidus. Nous avons également cartographié trois épitopes reconnus par l'anticorps HJT-R3-A9 scFv. Sur la base de la longueur, la majorité de ces séquences semblent être des épitopes linéaires. Nous avons identifié 16 épitopes dans le domaine P, allant de 8 à 38 résidus de longueur. La majorité de ces séquences ont moins de 20 résidus de long, ce qui suggère qu'il s'agit d'épitopes linéaires (Figs. 4b, 5, Tableau S1).

Bien que la majorité des épitopes aient été trouvés chez au moins deux individus, la constellation d'épitopes chez chaque individu est unique. Autrement dit, deux individus n'ont pas exactement le même ensemble d'épitopes. Ces résultats sont mieux visualisés dans un dendrogramme qui montre les similitudes entre les individus parmi les ensembles d'épitopes reconnus (Fig. 5). Par exemple, le dendrogramme montre que les individus 731, 750 et 732 ont un ensemble d'épitopes très similaire et donc une réponse anticorps similaire, tandis que les individus 720 et 750 ont une réponse anticorps plus divergente à l'infection. Il est également intéressant de noter qu'il y a plus d'épitopes observés dans VP1 pour les individus 731 et 732, dont les sérums ont été collectés 30 jours après l'infection, par rapport aux trois autres individus (715, 720 et 723) dont les sérums ont été collectés 14 jours après l'infection (Figs. 4, 5).

Pris ensemble, les résultats ont montré que le paysage antigénique comprend toutes les protéines non structurelles et structurelles, chaque personne contenant des anticorps dans son sérum polyclonal contre une collection unique d'épitopes linéaires et conformationnels qui sont néanmoins largement partagés par l'ensemble des individus.

Des études antérieures ont estimé que l'immunité protectrice contre les infections par HuNoV varie de 4,1 à 8,7 ans32,33,34. Cependant, le paysage antigénique associé à l'immunité humorale tout au long d'une infection n'est pas clair. Par conséquent, nous avons effectué une étude longitudinale du paysage épitopique associé à la réponse anticorps au cours des infections par HuNoV chez plusieurs individus. À cette fin, nous avons sondé les sérums recueillis sur une période de 180 jours, y compris cinq points de temps différents pour les sujets de l'étude 731, 732 et 750. Les cinq points de temps comprenaient la pré-infection, 7, 14, 30 et 180 jours après l'infection. La distribution du nombre d'inserts et les scores de couverture obtenus après deux cycles de sélection par affinité pour chaque point de temps ont révélé des épitopes le long des ORF HuNoV. Pour plus de clarté, seuls les épitopes des protéines non structurales ont été marqués. Chacun des participants à l'étude avait des anticorps reconnaissant des épitopes définis pour HuNoV dans les sérums de pré-infection, indiquant qu'ils avaient déjà été infectés par HuNoV (Figs. 6, S5). Ces épitopes préexistants ont été vérifiés en confirmant que la fraction d'inserts dans le cadre était supérieure dans les bibliothèques sélectionnées à celle de la bibliothèque naïve. Tous les épitopes identifiés chez l'individu 731 étaient préexistants et la majorité d'entre eux ont persisté tout au long de l'évolution de l'infection. Trois épitopes sont apparus après l'infection chez le sujet 732, qui sont les premiers épitopes dans NS1/2, NS5 et NS6, et un épitope qui est apparu après l'infection chez le sujet 750, qui est le premier épitope dans NS7 (Figs. 6, S5). Le reste des epitopes chez les sujets 732 et 750 étaient préexistants.

La couverture des inserts après deux cycles de sélection par affinité avec des sérums collectés à différents moments chez les sujets 731, 732 et 750 a été déterminée par alignement de la séquence d'ADN sur le plasmide contenant les ORF GI.1. Le score de couverture par nucléotide est indiqué sur l'axe y tandis que la position sur la séquence plasmidique est indiquée sur l'axe x. Les positions des ORF HuNoV 1 à 3 sont indiquées sous l'axe des x à titre de référence. Seuls les inserts du brin avant sont représentés. a La couverture des inserts après deux cycles de sélection par affinité avec les sérums du sujet 731 avant la provocation, et 7, 14, 30 et 180 jours après la provocation. b La couverture des inserts après deux cycles de sélection par affinité avec les sérums du sujet 732 avant la provocation, et 7, 14, 30 et 180 jours après la provocation. c La couverture des inserts après deux cycles de sélection par affinité avec le sujet 750 sérums avant la provocation, et 7, 14, 30 et 180 jours après la provocation. Les lignes pointillées représentent les épitopes préexistants qui persistent à partir des sérums de pré-infection jusqu'à 180 jours après l'infection, tandis que les lignes pleines représentent les épitopes qui émergent après l'infection.

Parmi les épitopes apparus après l'infection, l'épitope dans NS5 a montré un enrichissement accru pour les trois individus et a atteint les scores de couverture les plus élevés à 14 et 30 jours pour les sujets 731 et 750 et à 14 jours pour le sujet 732. Les épitopes dans NS4 et NS6 pour le sujet 732 ont également montré un enrichissement plus élevé à 14 jours jusqu'à 180 jours après l'infection. Cela indique que des réponses immunitaires ciblant des combinaisons des épitopes dans NS4, NS5 et NS6 ont été induites au début de l'infection pour différents individus. Enfin, 180 jours après l'infection, le nombre d'inserts et les scores de couverture sont revenus au paysage épitopique de base observé avant la provocation HuNoV pour la majorité des épitopes. Spécifiquement, les anticorps qui ont été induits après l'infection dans le cadre de la réponse adaptative sont également restés au jour 180 (c'est-à-dire, NS4 et NS6 pour le sujet 732). Dans l'ensemble, ces résultats montrent que le paysage épitopique diffère d'un individu à l'autre et que les anticorps présents lors d'une infection par HuNoV sont une combinaison d'anticorps préexistants vraisemblablement issus d'une infection antérieure ainsi que de nouveaux anticorps induits par le challenge HuNoV. Il convient de noter que ces anticorps persistants préexistants n'ont apparemment pas fourni de protection contre l'infection dans la mesure où tous ces individus ont été infectés en présence des anticorps.

Les norovirus sont génétiquement divers et sont classés en 10 génogroupes différents largement basés sur l'identité de séquence et sont subdivisés en 49 génotypes4. Idéalement, un vaccin contre les norovirus ciblerait les épitopes conservés à travers les génogroupes et les génotypes. GII.4 Les HuNoV ont été responsables de la majorité des épidémies au cours des 15 dernières années dans le monde35,36,37. Ils induisent également des symptômes plus sévères nécessitant une prise en charge médicale intense chez les enfants38. Pour mieux comprendre la réactivité croisée de la réponse immunitaire contre les HuNoV ainsi que le paysage antigénique du norovirus GII.4, nous avons généré une bibliothèque d'affichage de phage génomique cisaillé GII.4 HOV, en utilisant les mêmes méthodes que celles décrites pour la bibliothèque GI.1. Le séquençage en profondeur de la bibliothèque naïve GII.4 HOV a révélé une distribution dense des inserts directs et inverses le long de la séquence plasmidique avec les ORF GII.4 HOV (Fig. 7a, b). Environ huit millions d'inserts avant et cinq millions d'inserts inverses ont été alignés pour obtenir un score de couverture de position par nucléotide (Fig. 7c). Les résultats ont révélé une excellente couverture à chaque position de nucléotide du plasmide contenant le génome GII.4 HOV qui a été utilisé pour construire la banque. La distribution des tailles de peptides codés par les inserts varie d'environ 10 à 180 acides aminés avec une taille moyenne de 58 acides aminés (Fig. 7d). Semblable à la bibliothèque GI.1, la bibliothèque GII.4 HOV avait une distribution continue des tailles de peptides, indiquant que les tailles d'insert sont très diverses.

a Distribution des inserts de brin avant (rouge) dans la bibliothèque naïve cartographiée sur leurs positions dans le plasmide contenant les ORF GII.4 HOV. La position de l'extrémité 5' de l'insert dans le plasmide est indiquée en abscisse, tandis que la position de l'extrémité 3' de l'insert est désignée en ordonnée. Le nombre d'occurrences de l'insertion est défini en nombre sur l'axe z. b Répartition des inserts à brin inverse (noir) dans la bibliothèque naïve. c Couverture de la bibliothèque naïve définie par des alignements de séquences d'ADN. Un total de 8 364 766 inserts de brin avant et 5 535 252 inserts de brin inverse ont été alignés pour générer un score de couverture par position de nucléotide. Le score de couverture a été défini comme le nombre d'occurrences de chaque position de nucléotide dans l'ensemble de fragments d'insert d'ADN alignés pour les inserts de brin avant et les inserts de brin inverse, respectivement. Les scores de couverture pour les inserts de brin avant du plasmide (rouge) sont indiqués au-dessus de l'axe des x, tandis que les scores de couverture pour les inserts de brin inverse (gris) sont indiqués sous l'axe des x. d Distribution de la taille des peptides dans la bibliothèque naïve. La fréquence de chaque peptide unique est indiquée sur l'axe y tandis que la taille du peptide est indiquée sur l'axe x.

Nous avons effectué des sélections d'affinité à l'aide de la bibliothèque GII.4 HOV contre des sérums de trois personnes présentant des niveaux élevés d'anticorps sériques anti-GII.4 Sydney 2012, dont l'un (BCM16-1) avait une infection récente par le virus GII.4 Sydney 2012. Nous avons également effectué une sélection par affinité en utilisant la bibliothèque GII.4 HOV contre l'anticorps scFv HJT-R3-A9 et des antisérums de lapin anti-GI.1 VLP, qui se lient tous deux à GI.1 VP1. La fréquence des inserts codant pour les peptides HuNoV dans le cadre dans la bibliothèque naïve GII.4 HOV et après chaque cycle de sélection par affinité a été évaluée. La figure S6a montre que, similaire à la progression des sélections d'affinité des tours un à deux en utilisant la bibliothèque GI.1, la sélection d'affinité enrichie pour les séquences HuNoV qui se lient aux anticorps sériques. La fraction d'insertions dans le cadre pour chaque numéro de comptage, comme le montre la figure S6b, a également commencé à augmenter aux insertions avec un comptage de cinq, mais pas aussi apparente que les résultats pour GI.1. Les inserts avec un nombre de cinq ou plus ont été utilisés pour calculer les scores de couverture par position de nucléotide.

Le nombre d'inserts et les cartes de couverture générées après le séquençage en profondeur des sélections de la bibliothèque GII.4 HOV ont révélé des épitopes situés dans NS1/2 (p48), NS3 (NTPase), NS4 (p22), NS5 (VPg), NS6 (protéase) et NS7 (RdRp) (Fig. 8, S7, Tableau S2). Les épitopes cartographiés sur NS1/2 à partir des sérums des trois individus partagent un épitope des résidus 68 à 113 de l'ORF1. L'épitope dans NS3 était également partagé avec les trois personnes et a une longueur de 81 résidus (395–475), ce qui suggère qu'il s'agit d'un épitope conformationnel. L'épitope dans NS4 est également apparu chez les trois individus avec une séquence de 78 résidus (702–779). L'épitope dans NS5 a deux résidus qui chevauchent l'extrémité C-terminale de NS4 et sont apparus chez les trois individus. Cet épitope a une séquence commune de 69 résidus (872–942), suggérant qu'il s'agit d'un épitope conformationnel. Enfin, l'épitope dans NS6 chevauche NS5 et NS6 est également partagé entre les trois individus et est situé de la position 982 à 1029 de l'ORF1. Le dernier épitope n'était présent que chez le sujet BCM16-1 et se trouve dans NS7. Cet épitope est long de 64 résidus (1220–1283), suggérant à nouveau un épitope conformationnel (Fig. 8, S7, Tableau S2).

a La couverture des inserts dans la bibliothèque naïve (en haut) ainsi que les inserts après deux cycles de sélection par affinité avec des sérums de sujets sérums BCM16-1, sérums BCM13-1, sérums BCM16-2, anticorps polyclonaux de lapin anti-NV et anticorps scFv HJT-R3-A9 déterminés par alignement de la séquence d'ADN sur le plasmide contenant les ORF GII.4 HOV. Le score de couverture par nucléotide est indiqué sur l'axe y tandis que la position sur le plasmide est indiquée sur l'axe x. Les positions des ORF GII.4 HOV 1 à 3 sont indiquées sous l'axe des x à titre de référence. Seuls les inserts du brin avant sont représentés. b La fraction d'inserts dans le cadre dans ORF2 dans la bibliothèque naïve par rapport aux inserts dans le cadre après deux cycles de sélection par affinité avec des sérums de sujets BCM16-1, BCM13-1, BCM16-2, des anticorps polyclonaux de lapin anti-NV et l'anticorps HJT-R3-A9 scFv dans GII.4 HOV ORF2. Une fenêtre coulissante de huit acides aminés le long de GI.1 ORF2 est indiquée sur l'axe des x tandis que la fraction des inserts dans le cadre de la bibliothèque naïve (barres noires) et des bibliothèques après deux cycles de sélection d'affinité (barres rouges) est indiquée sur l'axe des y.

La sélection par affinité de la bibliothèque GII.4 HOV contre ces cibles a également montré un enrichissement des séquences de VP1. Comme pour l'expérience GI.1, nous avons divisé ORF2 en 68 fenêtres de 24 nucléotides, soit huit résidus de long, et comparé la fréquence des inserts dans le cadre des bibliothèques sélectionnées et de la bibliothèque naïve dans chaque fenêtre. Les inserts dans le cadre avec une fréquence plus élevée après sélection que celle de la bibliothèque naïve ont été alignés pour identifier les épitopes. Nous avons identifié un total de 18 épitopes dans VP1 avec 10 dans le domaine S, quatre dans le sous-domaine P1 et quatre dans le sous-domaine P2. Six individus avaient un épitope unique. Parmi les 30 individus qui avaient plus de deux épitopes, cinq épitopes dans le domaine NTD du S étaient présents chez les six individus, suggérant que ces cinq épitopes sont hautement immunogènes. (Fig. 8, Tableau S2). Les profils d'épitopes des sérums des trois individus ainsi que l'anticorps A9 et les sérums de lapin anti-NV sont présentés dans le dendrogramme, ce qui montre que les profils immunitaires entre l'anticorps A9 et les sérums anti-NV sont les plus similaires tandis que les profils parmi les sérums sont plus étroitement liés, BCM16-1 et BCM16-2 ayant le profil d'épitope le plus similaire (Fig. S8).

Dans l'ensemble, moins d'épitopes ont été identifiés en utilisant la bibliothèque GII.4 HOV contre les sérums d'individus infectés par GII.4 Sydney que celui observé dans les sélections de la bibliothèque GI.1 contre les sérums d'individus infectés par GI.1. Cela est probablement dû à l'utilisation de la bibliothèque GII.4 HOV contre des sérums d'individus infectés par un génotype GII.4 différent. De plus, les sérums GII.4 provenaient d'infections naturelles et la chronologie entre l'infection et la collecte des sérums n'est pas claire. Le moment de la collecte des sérums devrait avoir un impact sur les épitopes observés.

Étant donné que les individus n'étaient pas infectés par GII.4 HOV 2002 et que l'anticorps A9 et les sérums VLP anti-lapin ont identifié les épitopes GI.1 et GII.4, les épitopes identifiés à partir de la sélection par affinité de la bibliothèque GII.4 HOV par rapport à ces cibles seraient pour les anticorps à réaction croisée qui reconnaissent à la fois GI.1 et GII.4. Pour identifier les épitopes à réaction croisée et déterminer le niveau de conservation des séquences au sein des épitopes, nous avons aligné les séquences des épitopes GI.1 et GII.4 HOV (Fig. S9a) et calculé le pourcentage d'identité (PI) entre les séquences d'épitopes GI.1 et GII.4 HOV. Les alignements ont révélé que l'épitope NS7 a la valeur IP la plus élevée, 81, 4%, parmi tous les épitopes (Fig. S9a), indiquant que cet épitope est le plus conservé entre les génogroupes. L'épitope avec la valeur PI la plus faible (27,5 %) est celui de NS1/2. Dans VP1, l'épitope avec la valeur PI la plus élevée (79,5%) se trouve dans le domaine S, ou le 11ème épitope sur la Fig. S9a. L'épitope avec la valeur PI la plus faible (31,6%) se trouve dans le NTD du domaine S, ou le 7ème épitope dans S9a. Les niveaux élevés de conservation de la plupart des épitopes à réaction croisée dans les protéines non structurelles et structurelles suggèrent une intégration possible dans un vaccin largement protecteur s'ils présentent des propriétés de blocage de l'HBGA. En outre, ils pourraient être utilisés comme outils de diagnostic largement réactifs pour détecter les infections à norovirus (Fig. S9). Enfin, nous avons recherché les séquences des épitopes de norovirus identifiés ici à l'aide de la protéine BLAST et n'avons pas identifié de correspondances de similarité de séquence élevée avec des virus autres que les norovirus. Ainsi, les anticorps liant les épitopes que nous avons identifiés sont probablement spécifiques des norovirus.

Pris ensemble, les résultats des sérums post-infection HOV GI.1 et GII.4, des sérums anti-NV et de l'anticorps scFv HJT-R3-A9 ont montré que les sélections d'affinité d'affichage de phage couplées à un séquençage en profondeur peuvent être utilisées sur des sérums humains polyclonaux complexes pour identifier simultanément plusieurs épitopes. Nos données ont identifié 48 épitopes GI.1 et 24 GII.4 HOV dans les protéines non structurales et structurales. Des profils d'épitopes similaires ont été identifiés parmi les individus infectés, bien que des épitopes uniques soient également présents. Nous avons également observé que les épitopes changent au cours des infections, illustrant la nature dynamique de la réponse immunitaire adaptative. Enfin, nous avons observé des anticorps qui réagissent de manière croisée entre GI.1 et GII.4 HOV. Les 10 épitopes reconnus par les anticorps à réaction croisée ont le potentiel d'être incorporés dans un vaccin ou un outil de diagnostic pour la détection des infections à norovirus.

Ici, nous avons montré que l'affichage de phages assisté par Jun-Fos couplé à un séquençage en profondeur peut cartographier simultanément plusieurs épitopes à partir de sérums humains polyclonaux complexes. Nous avons utilisé cette approche avec les bibliothèques génomiques GI.1 et GII.4 HOV pour déterminer le paysage d'épitopes pour neuf sérums humains polyclonaux complexes d'individus infectés par HuNoV et une collection longitudinale de 15 sérums à partir de cinq moments de trois individus infectés. Nos données ont révélé plusieurs épitopes GI.1 chez chaque individu, y compris des épitopes dans les protéines non structurelles et structurelles. En utilisant les échantillons de sérums longitudinaux, nous avons observé que tous les individus avaient des épitopes préexistants ainsi que de nouveaux épitopes en raison de la réponse immunitaire adaptative résultant de l'infection GI.1 de défi. De plus, la cartographie des épitopes des sérums GI.1 et GII.4 a permis l'identification d'épitopes à réaction croisée. Au total, les résultats donnent un aperçu des réponses immunitaires humorales à l'infection par HuNoV.

Les Virus-Like-Particles (VLP), qui sont composées de la principale protéine structurale VP1, sont hautement immunogènes et sont des candidats vaccins en raison de leurs profils d'immunogénicité et d'épitopes bien étudiés39. En revanche, les paysages d'immunogénicité et d'épitopes des protéines non structurales HuNoV n'ont pas été aussi bien caractérisés. Cependant, il a été montré qu'un clone d'expression situé à l'extrémité C-terminale de NS3 (NTPase) et à l'extrémité N-terminale de NS4 (p22) isolé du criblage immunologique était réactif avec les sérums post-infection de norovirus GI.140. Un autre rapport a montré que les individus infectés par un norovirus GI.1 avaient une séroréponse à la protéine de fusion non structurale VPR, qui est composée de VPg, de protéase et de RdRp41. En outre, une étude récente portant sur les réponses immunitaires humorales contre HuNoV chez des enfants à travers l'Europe a rapporté une antigénicité dans NS1/2 (p48) et NS4 (p22)42. Notre travail élargit considérablement la compréhension de l'immunogénicité des protéines non structurelles grâce à l'identification d'épitopes dans plusieurs protéines non structurelles, y compris celles énumérées ci-dessus. Plus précisément, nous avons identifié 13 épitopes GI.1 et six épitopes GII.4 HOV dans des protéines non structurales.

L'emplacement des épitopes sur les structures protéiques fournit des indices quant à savoir si les anticorps se liant à ces épitopes possèdent des activités neutralisantes. Les structures aux rayons X de NS6 (protéase) et NS7 (RdRp)7,43,44,45,46 et l'analyse par résonance magnétique nucléaire (RMN) du norovirus murin VPg et un modèle d'homologie de HuNoV VPg47,48 sont disponibles. HuNoV NS5 (VPg) se lie de manière covalente à l'extrémité 5 'du génome de l'ARN viral et participe à l'initiation de la réplication de l'ARN viral. Les épitopes NS5 à réaction croisée pour GI.1 (984–1037) et GII.4 HOV (872–942) (Fig. S9) correspondent au noyau hélicoïdal structuré de VPg et incluent un résidu tyrosine critique (Y992 dans GI.1 et Y902 dans GII.4 HOV), suggérant que les anticorps qui se lient à ces épitopes peuvent directement inhiber l'étape de réplication de l'ARN viral47.

Nous avons également identifié des épitopes dans HuNoV NS6 (protéase) dans les HOV GI.1 et GII.4. L'épitope NS6 détecté à partir des sérums GI.1 (1095–1180) correspond à la fente de la protéase, qui comprend des résidus catalytiques clés dans le site actif (H1130 et E1154) (Fig. 9a)43,49. Des anticorps ciblant cet épitope pourraient donc inhiber l'activité catalytique de NS6. L'épitope GII.4 HOV NS6 (Fig. 9b) correspond aux 21 premiers résidus et n'inclut pas le site actif de la protéase43.

Emplacement des épitopes sur les structures GI.1 Norwalk et GII.4 HOV NS6 (protéase), GI.1 NS7 (RdRp), GI.1 VP1 et GII.4 HOV VP1. De gauche à droite, quatre diagrammes de surface pivotés de 90° dans le sens inverse des aiguilles d'une montre sur l'axe des ordonnées et deux diagrammes de surface pivotés de 90° dans le sens inverse des aiguilles d'une montre sur l'axe des x sont représentés pour la structure a GI.1 NS6 (PDB ID : 2FYQ), b GII.4 HOV NS6 structure (PDB ID : 6NIR), c GI.1 NS7 structure (PDB ID : 4NRT) et d GI.1 VP1 (PDB ID : 1IHM), e GII.4 VP1 (PDB ID : 7MRY) avec la localisation des épitopes.

Nous avons identifié quatre épitopes dans la protéine GI.1 NS7 (RdRp), responsable de la réplication de l'ARN viral. Deux des quatre épitopes GI.1 NS7 se chevauchent le site actif de NS7 dans la région de la palme (D1522, D1623, D1624) 50,51 et un autre épitope comprend des résidus dans la région du pouce (I1721, S1722, E1726, W1764, M1765) qui interdit le site C-Tide. 9c). Par conséquent, les anticorps qui se lient à ces épitopes de polymérase GI.1 pourraient inhiber la synthèse d'ARN.

Nous avons identifié 35 épitopes dans la protéine de capside majeure GI.1 VP1, dont 19 dans le domaine S, 12 dans le sous-domaine P1 et quatre dans le sous-domaine P2 (Fig. 9d). De nombreux épitopes alignés avec les épitopes notés par van Loben Sels et Green9. Les cinq premiers épitopes, qui couvrent les résidus 6 à 56, se trouvent dans le NTD du domaine S et sont hautement immunogènes car ils sont apparus chez les six sujets de l'étude. Il y avait 15 mAb GI.1 précédemment identifiés qui reconnaissent également des sites dans la région 1–43 du NTD du domaine S53. Les 14 autres épitopes du domaine S couvrent la plupart des huit brins β B à I7. Ceux-ci n'ont pas été signalés comme épitopes neutralisants. Le sous-domaine P2 est la région la plus antigénique et contient le site de liaison de l'HBGA humain lors d'infections virales54. Nous avons identifié quatre épitopes dans P2. Il a été démontré que ces épitopes étaient tous reconnus par des anticorps bloquant l'HBGA ou neutralisants (Fig. 9d)5,55. La majorité des épitopes conformationnels liés par des anticorps neutralisants tels que 5I2 et plusieurs nanocorps (Nano-7, Nano-62 et Nano-94) sont également contenus dans les épitopes GI.1 22e à 25e (Fig. 9d)56,57,58.

Nos résultats GII.4 HOV ont indiqué 18 épitopes dans VP1, dont 10 dans le domaine S, quatre dans le sous-domaine P1 et quatre dans le sous-domaine P2, la plupart des épitopes identifiés étant également discutés par van Loben Sels et Green9. De nombreux résidus dans les épitopes identifiés dans les sous-domaines P1 et P2 sont également conservés à travers les génotypes GII. Par exemple, une séquence continue dans les 4ème et 5ème épitopes dans le domaine GII.4 S illustré sur la figure 9e est hautement conservée à travers GII.4, GII.7 et GII.8 et est reconnue par MAb N2C359. Le 11e épitope du sous-domaine P2 sur la figure S9e contient également plusieurs résidus (A294, G295, S296, N298) qui sont hautement conservés dans de nombreux génotypes GII.4 et font partie de l'épitope A, qui a été précédemment identifié comme un épitope de blocage immunodominant. Le 12e épitope, également situé dans le sous-domaine P2, contient V327, qui est un résidu hautement conservé dans un autre épitope de blocage (épitope F) reconnu par GII.4F, un anticorps monoclonal humain généré après une infection aiguë63,65,71,72,73. Le 12ème épitope contient également une partie de l'épitope de blocage reconnu par un anticorps monoclonal spécifique de GII NORO-32074,75. Les 11ème et 12ème épitopes sont situés au sommet de VP1 (Fig. 9e). Nos 16e et 17e épitopes dans le sous-domaine P1 contiennent des résidus dans un épitope bloquant HBGA qui est reconnu par l'anticorps monoclonal 3C3G3 ainsi que les anticorps monoclonaux à réaction croisée NV23, NS22 et F12076,77,78,79. Les 16ème et 17ème épitopes sont situés du côté du VP1 (Fig. 9e). Enfin, nos 13e et 18e épitopes contiennent des résidus dans deux épitopes de blocage sous-dominants, C et I, qui se sont avérés avoir des titres de blocage et de neutralisation modestes70. Les épitopes des sous-domaines P1 et P2 que nous avons identifiés dans GI.1 et GII.4 HOV VP1 comprennent de nombreux résidus hautement conservés, à réaction croisée et clés ciblés par des anticorps bloquant HBGA. Il a été démontré que les anticorps qui inhibent le blocage de l'HBGA sont corrélés à la neutralisation clinique des GI.1 et GII.4 et à la protection contre les infections à HuNoV10,12,80. Certains épitopes antigéniques se sont également avérés fortement neutralisants (c'est-à-dire l'épitope A)70. Les épitopes GI.1 et GII.4 HOV qui contiennent des résidus bloquant HBGA seraient donc des candidats pour une incorporation dans des vaccins protecteurs.

Nos résultats montrent clairement que l'infection par HuNoV produit des anticorps qui se lient aux protéines non structurales. Cependant, des protéines non structurelles sont fabriquées à l'intérieur des cellules infectées par le virus, et on ne sait pas comment ces protéines seraient disponibles pour interagir avec les récepteurs des cellules B (BCR) afin de générer une réponse adaptative en anticorps. La lyse cellulaire après l'infection pourrait libérer des protéines non structurelles pour se lier aux récepteurs des lymphocytes, entraînant la production d'anticorps. L'apoptose de la cellule infectée est un mécanisme possible de lyse cellulaire pour libérer des protéines non structurelles. Lee et al. ont démontré que le norovirus murin NS1 et une forme de HuNoV NS1 sont sécrétés81. Ils ont émis l'hypothèse que la sécrétion de NS1 est couplée à l'apoptose puisqu'elle est facilitée par le clivage de la caspase-3. Une autre étude a révélé que lorsque seules les polyprotéines ORF1 du norovirus murin sont exprimées dans un système cellulaire eucaryote, l'apoptose est induite par l'activation de la caspase-982.

Une question supplémentaire est de savoir si les anticorps contre les protéines non structurelles pourraient assurer la protection contre l'infection. Comme indiqué ci-dessus, plusieurs des épitopes identifiés sont cartographiés sur le site actif ou les régions fonctionnelles de protéines non structurelles et pourraient bloquer l'activité. Cependant, on ne sait pas comment les anticorps auraient accès aux protéines non structurelles puisque les protéines fonctionnent dans les cellules infectées. Une autre voie par laquelle les anticorps pourraient améliorer la protection est par leurs fonctions effectrices Fc. Les anticorps obtenus à partir de protéines non structurelles peuvent activer les fonctions effectrices médiées par Fc qui sont utilisées pour éliminer les cellules infectées par le virus, y compris la cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps (ADCC) ou la phagocytose cellulaire dépendante des anticorps (ADCP)83.

Bien qu'il existe des rapports limités d'épitopes dans les protéines non structurelles HuNoV, plusieurs études antérieures ont démontré que les protéines non structurelles d'autres virus sont riches en épitopes. Par exemple, une étude sur des patients atteints de COVID-19 a identifié des épitopes IgG dans toutes les protéines non structurelles et accessoires du SRAS-CoV-284. Fait intéressant, les épitopes corrélés à l'augmentation de la survie des patients étaient concentrés dans les protéases NSP3 et NSP5, tandis que les épitopes IgG qui résident dans les protéines accessoires Spike, Nucleocapsid et ORF3a étaient associés à une mortalité accrue84. De plus, la découverte d'épitopes anti-NS1 à réaction croisée dans les virus de la dengue et du Zika a conduit à la suggestion que NS1 est un candidat vaccin viable et a conduit à une protection passive dans des modèles animaux85,86,87,88. On ne sait pas si les épitopes des protéines non structurales HuNoV offrent une protection contre l'infection. Cependant, nos résultats couplés aux découvertes avec d'autres virus suggèrent que les protéines non structurelles qui induisent des anticorps à réaction croisée sont des candidats pour une enquête plus approfondie et une utilisation possible comme outil de dépistage pour détecter les infections virales.

Nos résultats ont également démontré la nature dynamique de la réponse longitudinale des anticorps au cours d'une infection par HuNoV. Les épitopes identifiés dans les sérums de pré-infection étaient présents lorsque des épitopes de novo ont été induits après l'infection pour tous les sujets de l'étude. Une explication de cette observation est que les anticorps induits par la provocation étaient dirigés à la fois contre la souche GI.1 Norwalk et contre les souches qui infectaient auparavant les individus. Ces schémas sont similaires au "back-boosting" observé dans l'immunologie du virus de la grippe, où des réponses immunitaires sont induites contre des épitopes dans la souche actuellement infectante ainsi que les souches précédentes si les épitopes ont une forte homologie89. Cette immunité hétérogène où des titres accrus d'anticorps sont générés contre des épitopes conservés partagés entre les souches actuelles et précédentes a également été récemment observée dans les infections par le SRAS-CoV-290,91.

Nous avons utilisé une bibliothèque de présentation de phages génomiques GI.1 et GII.4 HOV et effectué des sélections d'affinité contre neuf sérums humains uniques, 12 sérums provenant de différents moments de trois infections HuNoV, un antisérum de lapin et un anticorps monoclonal scFV. Le séquençage en profondeur des inserts à partir des sélections d'affinité a identifié des épitopes dans de nombreuses protéines non structurales. Le rôle de ces anticorps liant ces épitopes, le cas échéant, pour l'immunité n'est pas clair et mérite une étude future. De plus, nos travaux ont révélé d'importants changements longitudinaux de la persistance des épitopes au cours des infections par HuNoV. Enfin, nous avons identifié des épitopes à réaction croisée dans les sérums d'individus infectés par GI.1 et GII.4, ce qui suggère que des anticorps inter-génogroupes sont produits pendant l'infection. Les travaux futurs avec des sérums d'une cohorte plus étendue permettront de mieux comprendre les épitopes et donc la dynamique des anticorps en ce qui concerne l'immunité contre les infections par HuNoV.

Au total, 21 échantillons de sérum ont été inclus dans cette étude. Six personnes qui ont été infectées au cours d'une étude d'infection expérimentale humaine GI.1 ont fourni 18 échantillons30, et trois personnes ayant des anticorps naturellement acquis contre les NoV GII.4 ont fourni des échantillons individuels. Les échantillons des sujets 715, 720 et 723 de l'étude GI.1 ont été prélevés deux semaines après la provocation ; des échantillons de 731, 732 et 750 ont été prélevés avant la provocation et 1, 2, 4 et ~ 26 semaines après la provocation. Les sujets 720, 723, 731 et 732 ont reçu un diagnostic de gastro-entérite après la provocation alors que les sujets 715 et 750 ne l'étaient pas30. Des échantillons de sérum de BCM13-1 ont été prélevés en 2013 tandis que BCM16-1 et BCM16-2 ont été prélevés en septembre et mai 2016, respectivement. L'étude a été approuvée par le Baylor College of Medicine Institutional Review Board.

La bibliothèque de phage display GI.1 pTP663 Jun-Fos contenant des inserts du plasmide pKS-NV68 KM cisaillé, qui code GI.1 ORF1 à ORF3, a été précédemment construite25. Un total de 12,8 μg de plasmide pKS-NV68 a été cisaillé à l'aide d'un ultrasonateur focalisé Covaris S2 jusqu'à une plage de taille de 100 à 500 pb. L'ADN cisaillé a été purifié à l'aide d'une colonne de purification PCR Qiagen et élué dans 50 μg de tampon Tris-Cl 10 mM (pH 8,5), ce qui a donné 56 ng/μl et 2,8 μg comme concentration finale et quantité d'ADN, respectivement. Les extrémités des fragments d'ADN de 2,8 μg résultants ont été émoussées et phosphorylées dans un tampon composé de 50 mM de Tris-Cl, 10 mM de MgCl2, 1 mM d'ATP, 10 mM de dithiothréitol (DTT), 0,4 mM de désoxynucléoside triphosphates (dNTP) et 15 unités d'ADN polymérase T4 (New England Biolabs [NEB]) et 50 unités de polynucléotide T4. kinase (NEB), et 5 unités d'ADN polymérase du fragment de Klenow, dans un volume total de 100 μg. Le mélange réactionnel a été incubé à 20 °C pendant 30 minutes, purifié à l'aide d'une colonne de purification PCR Qiagen et élué dans un tampon Tris-Cl 10 mM (pH 8,5).

Pour préparer les fragments d'ADN pour la ligation avec le plasmide pTP663 Jun-Fos phage display via clonage AT, de la désoxyadénosine a été ajoutée aux fragments d'ADN dont les extrémités ont été réparées mentionnés ci-dessus dans un mélange réactionnel de 50 μl contenant 50 mM de NaCl, 10 mM de Tris-Cl, 10 mM de MgCl2, 1 mM de DTT et 0,2 mM de dATP avec 15 unités d'exonucléase d'ADN polymérase de Klenow ( ONÉ). Le mélange réactionnel a été incubé pendant 30 min à 37°C, purifié et élué dans du tampon Tris-Cl 10 mM (pH 8,5).

Après croissance dans une souche dam-négative d'E. coli, le plasmide pTP663 Jun-Fos phage display a été préparé pour le clonage en purifiant l'ADN plasmidique à l'aide d'un kit Qiagen miniprep. Un total de 9 μg d'ADN plasmidique a été digéré avec XbaI dans du tampon NEB CutSmart 1X à 37 ˚C pendant 2 h dans un volume de 200 μl suivi de l'inactivation de XbaI à 65 ˚C pendant 10 min. Les extrémités d'ADN des plasmides pTP663 Jun-Fos phage display ont été rendues franches par addition de 4 μl de dNTP 10 mM et 2 μl d'ADN polymérase de Klenow (NEB) et incubation à 25 ˚C pendant 30 min, suivie d'une incubation à 70 ˚C pendant 10 min. Le mélange réactionnel a été purifié et élué dans un tampon Tris-Cl 10 mM (pH 8,5). La didésoxythymidine a été ajoutée à l'ADN purifié dans un mélange réactionnel de 100 ul avec un tampon de désoxynucléotidyl transférase (TdT) 1X terminal (NEB) avec 0, 25 mM de CoCl2, 0, 2 mM de ddTTP et 40 unités de TdT (NEB). Le mélange réactionnel contenant les plasmides à queue en T a été incubé pendant 1 h à 37 °C suivi de 10 min à 70 °C et séparé par électrophorèse sur gel d'agarose. La bande pTP663 de 5300 pb a été extraite avec un kit de purification sur gel Qiagen et éluée dans 80 μl de tampon Tris-Cl 10 mM (pH 8,5), résultant en une concentration finale de 6,7 ng/μl d'ADN de pTP663.

L'ADN cisaillé et A-Tailled de 100 à 500 pb (1,45 μg) a été ligaturé avec l'ADN vectoriel PTP663 en T (0,13 μg) dans un volume de réaction de 250 μl de trente de Tris-Cl de 50 mM, 10 mm mgcl2, 1 mm ATP, 10 mM de tampon DTT à 16 ick pour 12 h. La réaction a ensuite été extraite avec du phénol-chloroforme-éthanol isoamylique, précipitée dans 2 volumes d'éthanol à 100 % à -80 °C pendant 1 h et centrifugée à 13 000 tr/min pendant 15 min. Le culot d'ADN a été séché et remis en suspension dans du tampon TE (Tris-Cl 10 mM, EDTA 1 mM [pH 8, 0]), suivi d'une électroporation de 3 μl d'ADN dans 50 μl de cellules électrocompétentes E. coli XL1-Blue. Les cellules transformées ont été sélectionnées avec 100 μg/ml d'ampicilline sur des plaques de gélose. La taille de la bibliothèque a été estimée par le nombre de colonies et le pourcentage de clones avec des inserts a été déterminé par séquençage en profondeur des clones individuels. Les 445 000 colonies restantes ont été regroupées en mélangeant du milieu LB avec 100 μg/ml d'ampicilline avec les colonies sur les plaques de gélose dans une bouillie.

La production de phages à partir des cellules de la bibliothèque regroupée a été réalisée en ajoutant 0,1 ml des cellules de la bibliothèque regroupée à 30 ml de milieu 2YT avec 100 ug/ml d'ampicilline. La culture a été incubée à 37 °C sous agitation pendant environ 3 h jusqu'à ce que la densité optique à 600 nm (DO600) atteigne 0,6. Le phage 92 auxiliaire KM13 a été ajouté à 1 × 1010 phages/ml et les cultures ont été incubées pendant 30 min à 37 °C sans agitation, puis pendant 20 h à 30 °C avec agitation. L'élimination des cellules E. coli s'est faite par centrifugation et la précipitation des phages a été réalisée en ajoutant 1/5 volume de 20% de polyéthylène glycol 6000 (PEG 6000), 2,5 M NaCl. La solution a été incubée pendant une nuit à 4 °C, récupérée par centrifugation et remise en suspension dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 1X. Les inserts de la bibliothèque de présentation de phages GII.4 HOV pTP663 Jun-Fos du plasmide pKS-SagaFpA50 cisaillé codant GII.4 HOV ORF1 à ORF3 ont été préparés pour cette étude en utilisant les mêmes méthodes que celles décrites pour la bibliothèque de présentation de phages GI.1 pTP663 Jun-Fos.

Le premier tour de sélection par affinité a été effectué en plaçant 100 μl (1 mg) de billes magnétiques Pierce Protein A/G (Thermo Scientific, #88803) dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 ml et en lavant avec 1X TBS-T avec 0,05 % de Tween-20. Ensuite, 500 μl de sérums humains (dilué 1:50) ont été immobilisés sur les billes dans du TBS 1X à température ambiante pendant 1 h. Les sérums d'anticorps VLP anti-GI.1 de lapin ont été immobilisés sur des billes en suivant la même procédure. L'anticorps scFv HJT-R3-A9 a été préalablement purifié après expression protéique dans E. coli25,93. L'anticorps a été immobilisé à 200 μg/ml dans du TBS 1X sur les billes à température ambiante pendant 1 h. Pour tous les échantillons, après lavage avec 1 ml de TBS-T 1X avec 0,05 % de Tween-20, les tubes ont été placés sur un support magnétique où les billes magnétiques ont été collectées et le surnageant jeté. Les billes avec des sérums humains immobilisés, des sérums de lapin et l'anticorps HJT-R3-A9 ont ensuite été lavées trois fois avec 1 ml de 1X TBS-T avec 0,05% de Tween-20 et bloquées à température ambiante pendant 1 h avec 1 ml de 1X TBS-T avec 0,05% de Tween-20 et 0,5% de BSA. Les billes ont été lavées trois fois avec du TBS-T 1X avec du Tween-20 à 0, 05% et 5 × 1011 phages de la bibliothèque ont été ajoutés par tube dans du TBS 1X et incubés à température ambiante pendant 2 h. Les billes ont ensuite été lavées 3 fois avec du TBS-T 1X avec 0, 05% de Tween-20, et les phages ont été élues avec 500 μl par échantillon de glycine 0, 2 M (pH 2, 2), 1 mg / ml d'albumine de sérum bovin (BSA) tampon d'élution et neutralisé avec 100 μl de Tris 2 M (pH 8, 5) par tube. Une aliquote des phages élués (250 μl) a été utilisée pour infecter 1 ml de cellules E. coli XL1-Blue, ce mélange a été inoculé dans 50 ml de milieu 2YT contenant 100 μg/ml d'ampicilline, et un total de 1010 phages/ml, soit 100 μl, de phage auxiliaire M13KO7 (New England BioLabs, #N0315S), et la culture a été incubée pendant une nuit à 37 °C pour amplifier les phages. Les phages amplifiés ont été précipités à l'aide de PEG8000/NaCl 2,5 M et recueillis par centrifugation à 4 kg pendant 30 min. Ensuite, les phages ont été remis en suspension dans du PBS 1X et une petite aliquote a été utilisée pour déterminer le titre de phage. Cette préparation de phage a ensuite été utilisée pour le cycle suivant de sélection par affinité.

Une NGS à base d'amplicons avec la plate-forme Illumina a été réalisée pour déterminer les séquences d'ADN des inserts dans la bibliothèque naïve et après chaque cycle de sélection par affinité25. L'amplification par PCR a été réalisée en utilisant le phage amplifié de la bibliothèque naïve et les bibliothèques enrichies comme matrice. Les amorces de PCR contenaient une séquence de code-barres de 7 pb à l'extrémité 5'. La séquence de code-barres est unique à chaque mélange PCR et a pour but d'attribuer des séquences à chaque expérience. Après électrophorèse sur gel d'agarose et extraction sur gel, l'ADN a été extrait, purifié à l'aide d'un kit de purification de gel Qiagen, regroupé et utilisé pour Illumina NGS.

Des scripts Perl personnalisés ont été utilisés sur les fichiers fastq de séquençage profond pour trier les lectures, ou insertions, dans leurs expériences respectives en fonction des codes-barres associés aux amplicons. Un autre script Perl personnalisé a ensuite été utilisé pour aligner les séquences d'insertion sur le génome de référence afin de déterminer l'identité et le nombre d'occurrences de chaque insert dans chaque bibliothèque enrichie et la bibliothèque naïve. Le programme Gnuplot a été utilisé pour tracer les positions finales 5 ', les positions finales 3' et le nombre d'occurrences de chaque insert sur les axes x, y et z, respectivement. Les inserts avec un nombre de 5 ou plus ont été sélectionnés pour la détermination du score de couverture. Les scores de couverture ont été déterminés à l'aide du programme bedtools genomecov et ont été définis comme le nombre d'occurrences par nucléotide pour chaque insert après alignement sur le génome de référence : plasmide pKS-NV68 pour les expériences GI.1 et plasmide pKS-SagaFpA50 pour les expériences GII.4 HOV27,28,94. Les inserts qui sont dans le cadre de GI.1 et GII.4 HOV ORF1 à ORF3 dans les plasmides pKS-NV68 et pKS-SagaFpA50 ont été déterminés et comptés. Les ORF2 HOV GI.1 et GII.4 ont été divisés en fenêtres consécutives de 8 mères de long. Le rapport des inserts dans le cadre dans une fenêtre pour la bibliothèque naïve et les bibliothèques après les sélections d'affinité a été défini comme le nombre d'occurrences des inserts dans le cadre divisé par le nombre total d'inserts dans chaque fenêtre. Le rapport de tous les inserts dans le cadre dans la bibliothèque naïve et après chaque cycle de sélection par affinité pour chaque individu a été calculé en divisant le nombre d'inserts dans le cadre par le nombre total d'inserts dans l'expérience.

Un script Python personnalisé a été utilisé pour créer les blocs dans le dendrogramme. Seaborn, une bibliothèque de visualisation de données statistiques basée sur matplotlib, a été utilisée pour regrouper les blocs avec la cartographie sémantique et l'agrégation statistique nécessaires95.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Les ensembles de données générés pendant et/ou analysés pendant l'étude en cours sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

Des scripts Perl personnalisés ont été utilisés pour traiter les données de séquençage en profondeur et sont disponibles sur le lien Github : https://github.com/Palzkill-Lab/Norovirus_epitopes.

Bányai, K., Estes, MK, Martella, V. & Parashar, UD Gastro-entérite virale. Lancette 392, 175-186 (2018).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Ludwig-Begall, LF, Mauroy, A. & Thiry, E. Norovirus – l'état de l'art, près de cinquante ans après leur découverte initiale. Virus 13, 1541 (2021).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Robilotti, E., Deresinski, S. & Pinsky, BA Norovirus. Clin. Microbiol. Rév. 28, 134–164 (2015).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chhabra, P. et al. Classification mise à jour des génogroupes et génotypes de norovirus. J. Gen. Virol. https://doi.org/10.1099/jgv.0.001318 (2019).

Choi, J.-M., Hutson, AM, Estes, MK & Prasad, BVV Caractérisation structurelle à résolution atomique de la reconnaissance des antigènes des groupes histo-sanguins par le virus de Norwalk. Proc. Natl Acad. Sci. États-Unis 105, 9175–9180 (2008).

Newman, KL & Leon, JS Immunologie du Norovirus : des souris et des mécanismes. EUR. J. Immunol. 45, 2742–2757 (2015).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Prasad, BVV et al. Structure cristallographique aux rayons X de la capside du virus de Norwalk. Sciences 286, 287-290 (1999).

Article CAS PubMed Google Scholar

Vongpunsawad, S., Venkataram Prasad, BV & Estes, MK La protéine de capside mineure du virus Norwalk VP2 est associée au domaine de la coquille VP1. J. Virol. 87, 4818–4825 (2013).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

van Loben Sels, JM & Green, KY La topologie antigénique du norovirus telle que définie par la cartographie des épitopes des cellules B et T : implications pour les vaccins et les thérapeutiques universels. Virus 11, 432 (2019).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Reeck, A. et al. Corrélat sérologique de la protection contre la gastro-entérite induite par les norovirus. J. Infecter. Dis. 202, 1212-1218 (2010).

Article PubMed Google Scholar

Atmar, RL et al. Vaccin Norovirus contre la maladie expérimentale du virus Norwalk humain. N. Engl. J. Med. 365, 2178-2187 (2011).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Atmar, RL et al. Corrélats sérologiques de protection contre un norovirus GII.4. Clin. Vaccin. Immunol. 22, 923–929 (2015).

Article CAS Google Scholar

Lindesmith, LC et al. Immunoglobuline sérique un blocage croisé des norovirus humains. Ouvrez le forum Infect. Dis. 2, ofv084 (2015).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

van Loben Sels, JM et al. Une approche basée sur la luciférase pour mesurer les titres d'anticorps bloquant l'HBGA contre le norovirus humain. J. Virol. Méthodes 297, 114196 (2021).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Lindesmith, LC et al. Les analyses du répertoire des anticorps sériques révèlent les mécanismes des réponses de neutralisation des souches larges et pandémiques après la vaccination contre le norovirus humain. Immunité 50, 1530–1541.e8 (2019).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Smith, GP Phage de fusion filamenteux : nouveaux vecteurs d'expression qui affichent des antigènes clonés à la surface du virion. Sciences 228, 1315-1317 (1985).

Article CAS PubMed Google Scholar

Kumar, R., Parray, HA, Shrivastava, T., Sinha, S. & Luthra, K. Phage display bibliothèques d'anticorps : une approche robuste pour la génération d'anticorps monoclonaux humains recombinants. Int. J. Biol. Macromol. 135, 907–918 (2019).

Article CAS PubMed Google Scholar

Anand, T. et al. Technique d'affichage de phage comme outil de diagnostic et de sélection d'anticorps pour les coronavirus. Courant. Microbiol. 78, 1124-1134 (2021).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tan, Y., Tian, ​​T., Liu, W., Zhu, Z. & J. Yang, C. Avancées dans la technologie d'affichage de phages pour la bioanalyse. Biotechnol. J. 11, 732–745 (2016).

Article CAS PubMed Google Scholar

Saw, PE & Song, E.-W. Criblage par affichage sur phage de peptide thérapeutique pour le ciblage et la thérapie du cancer. Cellule protéique 10, 787–807 (2019).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Alfaleh, MA et al. Anticorps monoclonaux dérivés du phage display : du laboratoire au chevet du patient. Devant. Immunol. 11, 1986 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Shrock, E. et al. Le profilage des épitopes viraux des patients COVID-19 révèle une réactivité croisée et des corrélats de gravité. Sciences 370, eabd4250 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Stoddard, CI et al. Le profilage des épitopes révèle des signatures de liaison de la réponse immunitaire du SRAS-CoV-2 dans l'infection naturelle et la réactivité croisée avec les CoV humains endémiques. Cell Rep. 35, 109164 (2021).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Xu, GJ et al. Profilage sérologique complet des populations humaines à l'aide d'un virome humain synthétique. Sciences 348, aaa0698 (2015).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Huang, W. et al. Cartographie haute résolution des antigènes de norovirus humains via des sélections de bibliothèques de présentation de phages génomiques et un séquençage en profondeur. J. Virol. https://doi.org/10.1128/JVI.01495-20 (2020).

Zantow, J. et al. Exploitation des oligopeptides du microbiome intestinal par affichage fonctionnel du métaprotéome. Sci. Rep. 6, 34337 (2016).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dorrity, MW, Queitsch, C. & Fields, S. Identification à haut débit des polypeptides négatifs dominants dans la levure. Nat. Méthodes 16, 413–416 (2019).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Quinlan, AR BEDTools : l'outil de l'armée suisse pour l'analyse des caractéristiques du génome. Courant. Protocole Bioinforma. 47, 11.12.1-34 (2014).

Google Scholar

Atmar, RL et al. Excrétion du virus de Norwalk après une infection humaine expérimentale. Urgence Infecter. Dis. 14, 1553-1557 (2008).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Atmar, RL et al. Détermination de la dose infectieuse humaine à 50 % pour le virus de Norwalk. J. Infecter. Dis. 209, 1016-1022 (2014).

Article PubMed Google Scholar

Buus, S. et al. Cartographie haute résolution d'épitopes d'anticorps linéaires à l'aide de puces à peptides à ultra haute densité. Mol. Cellule. Protéome. 11, 1790–1800 (2012).

Article Google Scholar

Ayukekbong, JA et al. Schéma de circulation des souches de Norovirus GII au cours de l'infection naturelle. J.Clin. Microbiol. 52, 7 (2014).

Article Google Scholar

Simmons, K., Gambhir, M., Leon, J. et Lopman, B. Durée de l'immunité à la gastro-entérite à norovirus. Urgence Infecter. Dis. 19, 1260-1267 (2013).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Johnson, PC, Mathewson, JJ, DuPont, HL & Greenberg, HB Étude à défis multiples de la sensibilité de l'hôte à la gastro-entérite de Norwalk chez les adultes américains. J. Infecter. Dis. 161, 18–21 (1990).

Article CAS PubMed Google Scholar

Atmar, RL & Estes, MK Développement d'un vaccin contre le norovirus : prochaines étapes. Expert Rev. Vaccins 11, 1023–1025 (2012).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Canon, JL et al. Les tendances génétiques et épidémiologiques des épidémies de norovirus aux États-Unis de 2013 à 2016 ont démontré l'émergence de virus recombinants Novel GII.4. J.Clin. Microbiol 55, 2208-2221 (2017).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Richardson, C., Bargatze, RF, Goodwin, R. & Mendelman, PM Vaccins à particules de type norovirus pour la prévention de la gastro-entérite aiguë. Expert Rev. Vaccins 12, 155–167 (2013).

Article CAS PubMed Google Scholar

Haddadin, Z. et al. Caractéristiques du norovirus GII.4 par rapport à d'autres génotypes dans les infections pédiatriques sporadiques dans le comté de Davidson, Tennessee, États-Unis. Clin. Infecter. Dis. 73, e1525–e1531 (2021).

Article CAS PubMed Google Scholar

Debbink, K., Lindesmith, LC & Baric, RS L'état des vaccins contre les norovirus. Clin. Infecter. Dis. 58, 1746–1752 (2014).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Matsui, SM et al. L'isolement et la caractérisation d'un ADNc spécifique du virus de Norwalk. J.Clin. Investir. 87, 1456-1461 (1991).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hesse, S. et al. Réponses sérologiques à une protéine de fusion non structurale de norovirus après vaccination et infection. Clin. Vaccin. Immunol. 23, 181-183 (2016).

Article CAS Google Scholar

Villabruna, N. et al. Profilage des réponses immunitaires humorales au norovirus chez les enfants à travers l'Europe. Sci. Rep. 12, 14275 (2022).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Viskovska, MA et al. La protéase de norovirus GII.4 présente une protéolyse sensible au pH avec un appariement Arg-His unique dans le site catalytique. J. Virol. 93, e01479–18 (2019).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zeitler, CE, Estes, MK & Venkataram Prasad, BV Structure cristallographique aux rayons X de la protéase du virus Norwalk à une résolution de 1,5 Å. J. Virol. 80, 5050–5058 (2006).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jung, J. et al. Les structures cryo-EM haute résolution des coquilles de norovirus humain de la souche épidémique révèlent des variations de taille. Proc. Natl Acad. Sci. États-Unis 116, 12828–12832 (2019).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Croci, R. et al. Bases structurelles de l'inhibition de l'ARN polymérase dépendante de l'ARN norovirus par de nouveaux composés apparentés à la suramine. PLoS ONE 9, e91765 (2014).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Leen, EN et al. Structures des domaines centraux hélicoïdaux compacts des protéines VPg du calicivirus félin et du norovirus murin. J. Virol. 87, 5318–5330 (2013).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Medvedev, A., Viswanathan, P., May, J. & Korba, B. Régulation de la nucléotidylylation du norovirus humain VPg par la ProPol et la liaison du nucléoside triphosphate par sa séquence amino-terminale in vitro. Virologie 503, 37–45 (2017).

Article CAS PubMed Google Scholar

Muhaxhiri, Z. et al. Base structurelle de la spécificité du substrat et de l'inhibition de la protéase dans le virus de Norwalk. J. Virol. 87, 4281–4292 (2013).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Alam, I. et al. Structures cristallines de l'ARN polymérase ARN-dépendante du norovirus-1 murin en complexe avec la 2-thiouridine ou la ribavirine. Virologie 426, 143-151 (2012).

Article CAS PubMed Google Scholar

Zamyatkin, DF, Vine, F., Machin, A., Grochulski, P. & Ng, KK-S. La liaison du 2′-amino-2′-désoxycytidine-5′-triphosphate à la norovirus polymérase induit un réarrangement du site actif. J. Mol. Biol. 390, 10–16 (2009).

Article CAS PubMed Google Scholar

Ng, KK-S. et coll. La structure cristalline de la polymérase du virus Norwalk révèle l'extrémité carboxyle dans la fente du site actif. J. Biol. Chim. 279, 16638–16645 (2004).

Article CAS PubMed Google Scholar

Yoda, T. et al. Caractérisation des anticorps monoclonaux spécifiques du virus Norwalk GI générés contre la protéine de capside exprimée par Escherichia coli et de la réactivité de deux anticorps monoclonaux largement réactifs générés contre la capside GII vis-à-vis des fragments recombinants GI. BMC Microbiol. 1, 24 (2001).

Tan, M., Hegde, RS & Jiang, X. Le domaine P de la protéine de capside du norovirus forme un dimère et se lie aux récepteurs antigéniques du groupe histo-sanguin. J. Virol. 78, 6233–6242 (2004).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sapparapu, G. et al. Utilisation fréquente de l'isotype IgA dans les cellules B humaines codant pour de puissants anticorps monoclonaux spécifiques aux norovirus qui bloquent la liaison à l'HBGA. PLoS Pathog. 12, e1005719 (2016).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Ettayebi, K. & Hardy, ME Le scFv recombinant spécifique au norovirus inhibe la liaison des particules de type viral aux ligands cellulaires. Virole. J. 5, 21 (2008).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Shanker, S. et al. Base structurelle de la neutralisation des norovirus par un anticorps IgA humain bloquant l'HBGA. Proc. Natl Acad. Sci. États-Unis 113, E5830–E5837 (2016).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ruoff, K. et al. Base structurale des nanocorps ciblant le prototype de norovirus. J. Virol. 93, e02005–18 (2019).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Li, X. et al. Identification et caractérisation d'un épitope natif commun aux souches de norovirus GII/4, GII/7 et GII/8. Virus Rés. 140, 188–193 (2009).

Article CAS PubMed Google Scholar

Allen, DJ et al. Caractérisation d'un site exposé à la surface spécifique du variant de norovirus GII-4 impliqué dans la liaison des anticorps. Virole. J. 6, 150 (2009).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Lindesmith, LC, Donaldson, EF & Baric, RS Variation antigénique de la souche Norovirus GII.4. J. Virol. 85, 231-242 (2011).

Article CAS PubMed Google Scholar

Lindesmith, LC et al. L'émergence d'une souche de norovirus GII.4 est en corrélation avec des changements dans l'évolution des épitopes de blocage. J. Virol. 87, 2803–2813 (2013).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Debbink, K. et al. L'émergence d'une nouvelle souche de norovirus pandémique GII.4 Sydney est en corrélation avec l'évasion de l'immunité collective. J. Infecter. Dis. 208, 1877–1887 (2013).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lindesmith, LC et al. Réponses en anticorps à blocage large chez des volontaires humains après immunisation avec un vaccin candidat VLP multivalent à norovirus : analyses immunologiques à partir d'un essai clinique de phase I. PLoS Med. 12, e1001807 (2015).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Debbink, K. et al. L'évolution intra-hôte aboutit à des norovirus GII.4 antigéniquement distincts. J. Virol. 88, 7244–7255 (2014).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Parra, GI et al. Plusieurs sites antigéniques sont impliqués dans le blocage de l'interaction de la capside du norovirus GII.4 avec les antigènes du groupe sanguin ABH. J. Virol. 86, 7414–7426 (2012).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Debbink, K., Lindesmith, LC, Donaldson, EF, Swanstrom, J. & Baric, RS Les vaccins à base de particules de type norovirus chimérique GII.4 induisent un blocage général des réponses immunitaires. J. Virol. 88, 7256–7266 (2014).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Lindesmith, LC et al. La plasticité de l'épitope D du norovirus humain permet d'échapper à l'immunité des anticorps sans perte de capacité à se lier aux ligands cellulaires. J. Virol. 93, e01813–e01818 (2019).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Lindesmith, LC et al. Caractérisation antigénique d'une nouvelle souche de norovirus recombinant GII.P16-GII.4 Sydney avec une variation de séquence mineure conduisant à une fuite d'anticorps. J. Infecter. Dis. 217, 1145-1152 (2018).

Article CAS PubMed Google Scholar

Tohma, K., Ford-Siltz, LA, Kendra, JA et Parra, GI Hiérarchie d'immunodominance dynamique des réponses d'anticorps neutralisants aux norovirus GII.4 en évolution. Cell Rep. 39, 110689 (2022).

Article CAS PubMed Google Scholar

Debbink, K., Lindesmith, LC, Donaldson, EF & Baric, RS Immunité aux norovirus et la grande évasion. PLoS Pathog. 8, e1002921 (2012).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lindesmith, LC et al. La conformation des particules régule l'accès des anticorps à un épitope de blocage du norovirus GII.4 conservé. J. Virol. 88, 8826–8842 (2014).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Lindesmith, LC et al. Occlusion conformationnelle des épitopes d'anticorps de blocage, un nouveau mécanisme d'évasion immunitaire du norovirus humain GII.4. mSphere 3, e00518–17 (2018).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Alvarado, G. et al. Anticorps monoclonaux humains qui neutralisent les norovirus pandémiques GII.4. Gastroentérologie 155, 1898–1907 (2018).

Article CAS PubMed Google Scholar

Alvarado, G. et al. Anticorps humains à réaction croisée large qui inhibent les norovirus des génogroupes I et II. Nat. Commun. 12, 4320 (2021).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Crawford, SE et al. Cartographie des anticorps monoclonaux des norovirus des génogroupes I et II largement réactifs. Clin. Vaccin. Immunol. 22, 168-177 (2015).

Article Google Scholar

Koromyslova, AD, Morozov, VA, Hefele, L. & Hansman, GS Norovirus humain neutralisé par un anticorps monoclonal ciblant la poche d'antigène du groupe histo-sang. J. Virol. 93, e02174–18 (2019).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Carmona-Vicente, N. et al. Caractérisation d'un nouvel épitope conformationnel de norovirus GII.4 : implications pour les interactions norovirus-hôte. J. Virol. 90, 7703–7714 (2016).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Carmona-Vicente, N., Allen, DJ, Rodríguez-Díaz, J., Iturriza-Gómara, M. & Buesa, J. Les anticorps dirigés contre les antigènes de Lewis inhibent la liaison des particules de type virus du norovirus humain GII.4 à la salive mais pas aux cellules Caco-2 intestinales. Virole. J. 13, 82 (2016).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Atmar, RL et al. Comparaison des tests de microneutralisation et de blocage de l'antigène du groupe sanguin histo pour la détection fonctionnelle des anticorps norovirus. J. Infecter. Dis. jiz526, https://doi.org/10.1093/infdis/jiz526 (2019).

Lee, S. et al. Une protéine virale non structurale sécrétée détermine la pathogenèse intestinale du norovirus. Microbe hôte cellulaire 25, 845–857.e5 (2019).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hérode, MR et al. L'expression de la polyprotéine ORF1 du norovirus murin (MNV) est suffisante pour induire l'apoptose dans un modèle cellulaire exempt de virus. PLoS ONE 9, e90679 (2014).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Bailey, MJ et al. Les anticorps produits par un vaccin à base de NS1 protègent les souris contre le virus Zika. mBio 10, e02861–18 (2019).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cheng, L. et al. La cartographie dynamique du paysage de l'immunité humorale contre le SRAS-CoV-2 identifie les anticorps protéiques non structurels associés à la survie des patients critiques atteints de COVID-19. Sig. Transduct. Cible Ther. 6, 304 (2021).

Article CAS Google Scholar

Reyes-Sandoval, A. & Ludert, JE Le double rôle de la réponse anticorps contre la protéine non structurale 1 (NS1) du flavivirus dans la protection et l'immuno-pathogenèse. Devant. Immunol. 10, 1651 (2019).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wessel, AW et al. Les anticorps monoclonaux humains dirigés contre la protéine NS1 protègent contre l'infection mortelle par le virus du Nil occidental. mBio 12, e02440–21 (2021).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Modhiran, N. et al. Un anticorps largement protecteur qui cible la protéine du flavivirus NS1. Sciences 371, 190-194 (2021).

Article CAS PubMed Google Scholar

Biering, SB et al. Base structurelle de l'inhibition par les anticorps du dysfonctionnement endothélial déclenché par le flavivirus NS1. Sciences 371, 194-200 (2021).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Fonville, JM et al. Paysages d'anticorps après une infection ou une vaccination par le virus de la grippe. Sciences 346, 996-1000 (2014).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Amanat, F. et al. La vaccination par l'ARNm du SRAS-CoV-2 induit des anticorps fonctionnellement divers contre NTD, RBD et S2. Cellule 184, 3936–3948.e10 (2021).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Aydillo, T. et al. Empreinte immunologique de la réponse anticorps chez les patients COVID-19. Nat. Commun. 12, 3781 (2021).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kristensen, P. & Winter, G. Sélection protéolytique pour le repliement des protéines à l'aide de bactériophages filamenteux. Pli. Dés. 3, 321–328 (1998).

Article CAS PubMed Google Scholar

Huang, W. et al. Identification d'anticorps humains à chaîne unique avec une large réactivité pour les norovirus. Protéine Ing. Dés. Sél. 27, 339-349 (2014).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Huang, W., Soeung, V., Boragine, DM & Palzkill, T. Cartographie des peptides d'interface d'interaction protéine-protéine avec affichage de phage assisté par Jun-Fos et séquençage en profondeur. Synthé ACS. Biol. 9, 1882–1896 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Waskom, M. Seaborn : visualisation de données statistiques. JOSS 6, 3021 (2021).

Article Google Scholar

Télécharger les références

Ce travail a été financé par la subvention NIH P01 AI057788 et partiellement par U19 AI 144297. Nous remercions Eunna Huh pour la génération de la Fig. 5 et de la Fig. 7 supplémentaire. Nous remercions également Nathaniel Jansen pour son examen de l'analyse informatique.

Département de pharmacologie et de biologie chimique, Baylor College of Medicine, Houston, TX, 77030, États-Unis

Lynn Su, Wanzhi Huang et Timothy Palzkill

Département de virologie moléculaire et de microbiologie, Baylor College of Medicine, Houston, TX, 77030, États-Unis

Frederick H. Neill, Mary K. Estes et Robert L. Atmar

Département de médecine, Baylor College of Medicine, Houston, TX, 77030, États-Unis

Mary K. Estes et Robert L. Atmar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

LS a effectué les tests de phage display, analysé les ensembles de données de séquençage en profondeur et composé le manuscrit. WH a construit les bibliothèques de phage display et purifié l'anticorps utilisé dans cette étude. RLA et FHN ont dirigé l'étude expérimentale sur l'infection humaine où ils ont collecté et caractérisé les échantillons de sérum utilisés dans cette étude. TP, MKE et RLA ont développé l'idée conceptuelle du projet et étaient responsables de la planification et de la direction globales du projet. TP, MKE et RLA étaient également responsables de la révision critique du manuscrit.

Correspondance à Timothy Palzkill.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

Libre accès Cet article est sous licence Creative Commons Attribution 4.0 International, qui permet l'utilisation, le partage, l'adaptation, la distribution et la reproduction sur n'importe quel support ou format, à condition que vous accordiez le crédit approprié à l'auteur ou aux auteurs originaux et à la source, fournissez un lien vers la licence Creative Commons et indiquez si des modifications ont été apportées. Les images ou tout autre matériel tiers dans cet article sont inclus dans la licence Creative Commons de l'article, sauf indication contraire dans une ligne de crédit au matériel. Si le matériel n'est pas inclus dans la licence Creative Commons de l'article et que votre utilisation prévue n'est pas autorisée par la réglementation légale ou dépasse l'utilisation autorisée, vous devrez obtenir l'autorisation directement du détenteur des droits d'auteur. Pour voir une copie de cette licence, visitez http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Réimpressions et autorisations

Su, L., Huang, W., Neill, FH et al. La cartographie des antigènes norovirus humains au cours de l'infection révèle l'étendue de la réponse immunitaire humorale. npj Vaccins 8, 87 (2023). https://doi.org/10.1038/s41541-023-00683-1

Télécharger la citation

Reçu : 12 octobre 2022

Accepté : 25 mai 2023

Publié: 06 juin 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41541-023-00683-1

Toute personne avec qui vous partagez le lien suivant pourra lire ce contenu :

Désolé, aucun lien partageable n'est actuellement disponible pour cet article.

Fourni par l'initiative de partage de contenu Springer Nature SharedIt