Prostaglandine

Communications Biology volume 5, Article number: 1169 (2022) Citer cet article

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Les analogues de la prostaglandine sont des traitements de première intention pour le glaucome à angle ouvert et, bien qu'efficaces pour abaisser la pression intraoculaire, ils sont compromis par la non-observance du patient, provoquant une atrophie du nerf optique et une déficience visuelle sévère. Ici, nous évaluons l'innocuité et l'efficacité d'une thérapie génique médiée par un vecteur viral adéno-associé recombinant visant à abaisser de façon permanente la pression intraoculaire par la biosynthèse de novo de la prostaglandine F2α dans la chambre antérieure. Cette étude a démontré une réduction dose-dépendante de la pression intraoculaire chez des rats bruns normotendus maintenue pendant 12 mois. Fondamentalement, le traitement pourrait être temporairement interrompu par l'activation d'un riboswitch hors type, ramenant la pression intraoculaire à la normale. L'imagerie multimodale longitudinale, l'électrophysiologie et l'histologie post-mortem ont révélé que la thérapie était bien tolérée à des doses faibles et moyennes, sans effets indésirables majeurs sur la santé de la chambre antérieure, offrant une alternative prometteuse aux stratégies de traitement actuelles conduisant à des réductions cliniquement pertinentes de la pression intraoculaire sans la nécessité d'adhérer à un régime de traitement quotidien.

Le glaucome à angle ouvert (GAO) est un trouble oculaire complexe affectant environ 79,6 millions de personnes dans le monde, entraînant une perte progressive des cellules ganglionnaires rétiniennes, des lésions axonales dans le nerf optique et, finalement, la cécité1. Alors que le glaucome à angle ouvert présente de multiples facteurs de risque environnementaux et génétiques, la physiopathologie sous-jacente à l'élévation de la PIO est centrée sur le déséquilibre entre la production d'humeur aqueuse par le corps ciliaire et le drainage aqueux à travers le réseau trabéculaire2. Par conséquent, les stratégies de traitement actuelles, à la fois pharmacologiques et chirurgicales, se concentrent sur la réduction de la PIO soit par l'inhibition de la production aqueuse, soit par l'augmentation du drainage aqueux, dans le but de réduire la pression mécanique sur la rétine et le nerf optique afin de préserver la vision3, 4,5.

Les agents pharmacologiques sont administrés en tant que traitements de première ligne et se répartissent en cinq classes principales - les inhibiteurs de l'anhydrase carbonique, les agonistes adrénergiques, les inhibiteurs de la RHO kinase, les bêta-bloquants et les analogues de la prostaglandine F2α (PGF2α) - ces derniers étant les plus largement utilisés6,7,8. Les analogues de PGF2α, tels que le latanoprost, le bimatoprost et le travoprost, sont appliqués localement en tant que pro-médicaments sur la surface cornéenne via des gouttes oculaires, où ils sont absorbés à travers l'épithélium cornéen et hydrolysés en conformations actives lorsqu'ils traversent le stroma, avant d'être libérés dans l'humeur aqueuse. Après libération dans l'humeur aqueuse, les analogues de PGF2α entraînent un drainage accru par la voie d'écoulement uvéosclérale suite au remodelage de la matrice extracellulaire entourant le muscle ciliaire6,9,10,11,12,13. Bien que l'utilisation d'agents topiques puisse être efficace, entraînant une réduction de la PIO d'environ 25 %, leur utilisation est associée à de nombreux effets secondaires, notamment une irritation de la surface oculaire, une vision floue, une décoloration de l'iris (hyperpigmentation), des rougeurs (hyperémie), une croissance excessive ou épaississement des cils (hypertrichose), approfondissement des paupières (orbitopathie), hypersensibilité à la lumière et récurrence d'infections concomitantes (p. ex., kératite herpétique)14,15,16,17,18. En raison de la faible tolérance des traitements pharmacologiques actuels du GAO, associée aux difficultés associées à l'application correcte des gouttes ophtalmiques et à l'absence de rétroaction négative immédiate lorsque les doses sont manquées, les patients ont souvent du mal à respecter les schémas thérapeutiques quotidiens. En effet, les études dans lesquelles l'utilisation des gouttes ophtalmiques par les patients était surveillée électroniquement ont démontré une observance extrêmement médiocre des traitements pharmacologiques existants, 44 % des patients utilisant leurs gouttes oculaires moins de 75 % du temps19,20.

Par conséquent, ces dernières années, il y a eu une volonté de développer des traitements pharmacologiques à action plus longue en mettant l'accent sur les implants médicamenteux à libération prolongée, qui ont été étudiés à la fois dans des essais cliniques sur de grands animaux et sur des humains21,22,23,24,25,26. Il a été démontré que les implants, tels que le bimatoprost à libération prolongée, entraînent une réduction de la PIO pendant jusqu'à 24 mois ; cependant, seuls 28 % des participants ont maintenu une PIO contrôlée au cours de cette période et 26,5 % des patients supplémentaires ont eu besoin de gouttes ophtalmiques de secours ou d'une nouvelle administration d'implants après la dégradation23. En plus d'obtenir une réduction soutenue de la PIO chez la majorité des patients, un autre avantage notable de ces implants est que l'incidence de certains effets secondaires a été réduite par rapport aux patients recevant des gouttes ophtalmiques topiques, bien que les patients recevant du bimatoprost à libération prolongée aient présenté une hyperémie conjonctivale. , œdème maculaire et inflammation intraoculaire27. Bien que les implants se soient avérés relativement sûrs, certains patients développent une perte de cellules endothéliales cornéennes à la suite du remplacement de l'implant et, à ce titre, la Federal Drug Administration (FDA) a jusqu'à présent limité les patients à un implant de 10 µg par œil sans ré- administration autorisée27.

Bien que l'étiologie génétique sous-jacente au développement de l'OAG soit incomplètement comprise chez la majorité des patients, la thérapie génique reste une stratégie thérapeutique attrayante qui peut permettre une correction à vie du phénotype de la maladie après une seule intervention28,29,30. En raison des propriétés uniques de l'œil, les indications ophtalmiques ont été à l'avant-garde du domaine de la thérapie génique au cours des dernières décennies et se sont généralement concentrées sur l'utilisation de vecteurs de virus adéno-associés recombinants (rAAV), qui ont été montrés dans de nombreux études précliniques et cliniques pour médier l'expression sûre et persistante du transgène dans une variété de types de cellules oculaires et à travers une gamme d'espèces31,32,33,34,35. Alors que la majorité des études se sont concentrées sur le traitement de troubles rétiniens monogéniques héréditaires rares, tels que l'amaurose congénitale de Leber, la choroïdérémie et l'achromatopsie, la thérapie génique peut également être utilisée pour traiter des maladies d'étiologie complexe, telles que l'OAG, tant que la physiopathologie sous-jacente est bien comprise36,37,38,39,40,41,42. Comme des décennies de pratique clinique ont démontré une corrélation claire entre la réduction de la PIO et des résultats visuels positifs chez les patients atteints d'OAG, nous proposons que l'hypertension oculaire représente un facteur de risque clair et modifiable qui pourrait être modulé via une approche de thérapie génique afin de préserver la vision dans l'OAG. les patients. Plus précisément, comme les analogues de la prostaglandine sont un étalon-or pour le traitement de l'OAG et sont très efficaces pour réduire la PIO lorsqu'ils ne sont pas minés par une mauvaise observance du patient, nous avons cherché à développer un traitement de thérapie génique pour conduire la biosynthèse de PGF2α directement dans l'œil par le biais d'une sur-médiation rAAV. expression de la prostaglandine-endoperoxyde synthase 2 (COX2) - l'enzyme limitant la vitesse dans la biosynthèse de PGF2α - à partir des cellules de la chambre antérieure43. Nous émettons l'hypothèse que le développement d'une thérapie génique médiée par le rAAV pour synthétiser et libérer la PGF2α native pourrait être suffisant pour abaisser la PIO de manière sûre et durable, conduisant à de meilleurs résultats visuels grâce à l'élimination de la non-observance du patient tout en réduisant l'incidence et la gravité des effets secondaires observés lorsque les analogues de la prostaglandine sont administrés par voie topique.

Ici, nous utilisons des rats Brown Norway (BN) normotendus pour évaluer l'innocuité et l'efficacité de notre traitement de thérapie génique rAAV exprimant PGF2α visant à abaisser la PIO chez les patients souffrant d'hypertension oculaire après une dose thérapeutique unique. En utilisant une combinaison d'imagerie multimodale, d'électrophysiologie, de tonométrie et d'histologie post-mortem, nous démontrons une relation dose-dépendante claire entre les génomes de vecteurs administrés et la PIO. De manière significative, nous avons obtenu une réduction cliniquement pertinente de l'hypertension oculaire pendant une période de 12 mois à une dose bien tolérée. De manière unique, grâce à l'inclusion d'éléments riboswitch sensibles à la tétracycline dans la cassette d'expression, nous démontrons que l'expression du transgène peut être temporairement, mais efficacement, « désactivée » par l'administration d'un médicament oral, entraînant une réversion vers la normotension. Cette thérapie représenterait un changement de paradigme dans la gestion clinique de l'OAG, permettant d'améliorer les résultats visuels en supprimant les problèmes de conformité des patients et en augmentant la qualité de vie des patients grâce à une diminution du fardeau médical, des coûts et des effets secondaires réduits.

Afin de faciliter la production de novo de PGF2α à partir de cellules de la chambre antérieure, nous avons d'abord cloné une cassette d'expression codant pour la COX2 humaine optimisée en codons - l'enzyme limitant la vitesse dans la biosynthèse de PGF2α - en plus du récepteur de la prostaglandine F humaine (PTGFR) séparé par un Site de clivage P2A et piloté par un petit promoteur d'actine bêta de poulet (CBA) exprimant de manière omniprésente. L'inclusion de PTGFR dans la construction d'expression a été choisie afin de construire un « circuit biologique » dans lequel la molécule effectrice (PGF2α) et son propre récepteur sont présents à des niveaux élevés dans le tissu cible, une stratégie qui a déjà été démontrée chez les chats pour conduisent à une plus grande réduction de la PIO que l'expression de COX2 seule44.

La cassette d'expression est flanquée de répétitions terminales inversées (ITR) dérivées de l'AAV2 pour permettre l'encapsidation dans un vecteur rAAV recombinant, et contient également deux éléments de riboswitch sensibles à la tétracycline « hors-type » (TC40 et TC45), dont nous avons démontré précédemment qu'ils permettent pour la régulation négative post-transcriptionnelle de l'expression du transgène à partir d'un vecteur rAAV injecté dans l'œil lors de l'administration orale du ligand activateur (c'est-à-dire la tétracycline)45,46. Bien que les ribocommutateurs TC40 et TC45 n'aient pas été exprimés dans les cellules de la chambre antérieure, on sait que la tétracycline s'accumule dans la cornée et l'humeur aqueuse après administration orale et, en tant que telle, devrait être biodisponible pour les éléments du ribocommutateur pour piloter la modulation génique47. L'inclusion d'un interrupteur d'arrêt dans la cassette d'expression est une considération essentielle pour le développement de tout traitement de thérapie génique abaissant la PIO à base de prostaglandines, où la gestion clinique de l'OAG peut nécessiter l'arrêt temporaire du traitement PGF2α dans le cas où un patient développerait une maladie concomitante. infection, comme la kératite herpétique18,48,49.

L'activité biologique de la construction résultante CBA.COX2.P2A.PTGFR.TC40/TC45 (appelée ici CCPP) (Fig. 1a) a été initialement validée in vitro par transfection de cellules HEK293T, entraînant une augmentation significative (test T non apparié, p = 0, 0056, N = 2 (transfecté de manière fictive), N = 3 (transfecté par CCPP)) niveaux de PGF2α sécrétés dans le milieu de culture par rapport aux témoins transfectés de manière fictive (Fig. 1b). Après avoir établi que la cassette d'expression CCPP catalyse une production significativement accrue de PGF2α, la construction a ensuite été empaquetée dans rAAV2/2[MAX], un vecteur mutant de capside dérivé de rAAV2 contenant plusieurs mutations ponctuelles (Quad YF + TV : Y272F, Y444F, Y500F , Y730F et T491V) et une insertion peptidique (7m8 : R588_Q589insLALGETTRPA) connue pour augmenter l'efficacité de la transduction et la pénétrance tissulaire dans plusieurs types de cellules oculaires50,51,52. Lorsqu'il est injecté dans la chambre antérieure de rats BN, ce vecteur de sérotype mutant de capside transduit les cellules de l'endothélium cornéen périphérique, de l'iris et de l'angle iridocornéen (Fig. 1c, d).

Une représentation schématique du transgène CCPP piloté par un activateur CMV et un promoteur smCBA tout en contenant deux riboswitches hors-type de tétracycline (TC40 et TC45), ainsi que des codons humains optimisés COX2 et PTGFR séparés par un signal de clivage P2A (a). Un ELISA PGF2ɑ a confirmé des concentrations significativement plus élevées de PGF2ɑ dans les milieux de culture cellulaire après transfection avec le transgène CCPP que les milieux prélevés à partir de cellules transfectées fictives (b) (test T non apparié, p = 0,0056, N = 2 (transfecté fictivement) N = 3 (CCPP transfecté), barres d'erreur = SD). L'imagerie en fond clair et fluorescente des yeux rAAV2/2[MAX]-smCBA-mCherry 8 semaines après l'injection confirme le tropisme vectoriel dans l'iris, l'endothélium cornéen et le corps ciliaire (c, d). Barre d'échelle = 150 µm, Grossissement = 20×.

Des rats BN juvéniles (semaines post-natales 6 à 8) (N = 30 : 15 mâles et 15 femelles) importés d'un élevage commercial ont subi des examens ophtalmologiques complets pour exclure la présence d'anomalies du développement ou d'autres anomalies de la structure ou de la fonction rétinienne ou cornéenne. Il est important de noter que tous les animaux présentaient une pression intraoculaire stable (PIO ; 19,52 ± 3,23 mmHg, 1 SD, N = 30 yeux) avant de recevoir des injections intra-oculaires de rAAV2/2[MAX].CCPP. Des rats BN ont été assignés au hasard à l'une des trois cohortes expérimentales et ont reçu une injection intracamérulaire unilatérale de volume égal (10 μl) contenant soit un faible (3,9 × 109 vg/œil), un moyen (3,9 × 1010 vg/œil) ou un haut (3,9 × 1011 vg/œil) dose de vecteur rAAV2/2[MAX].CCPP purifié. L'œil controlatéral chez tous les animaux est resté non injecté pour servir de contrôle intra-animal et pour limiter tout reflux de vecteur pouvant survenir lors du repositionnement de l'animal.

À 1, 2, 6, 9 et 12 mois après l'injection, la tonométrie de rebond a été répétée sur des rats BN conscients par des examinateurs masqués par rapport au groupe de traitement pour permettre des modifications de la PIO en réponse au traitement. mesuré objectivement. Les rats BN à faible dose ont présenté des réductions non significatives (NS) de la PIO à tous les points au cours du temps par rapport aux mesures de base (Fig. 2a; test de comparaison multiple de Dunnett, p ≥ 0, 05 toutes les comparaisons, N = 11) et aucune tendance significative n'a été observée. observé sur l'ensemble de la période d'évaluation de 12 mois (Fig. 2b ; régression linéaire simple, p = 0,1549).

Une réduction dose-dépendante de la PIO a été observée entre les groupes : les animaux recevant des doses faibles, moyennes et élevées ont montré une réduction de 12,6 %, 21,87 % et 43,2 % à 12 mois respectivement (a, c et e) qui s'est maintenue pendant 12 mois (b ; régression linéaire simple, p = 0,1549, N = 11 d ; p = 0,0036, N = 9 et f ; p < 0,0001, N = 10, barres d'erreur = SD). À 12 mois, les animaux ont reçu un régime de tétracycline à 5 % p/p et la PIO a augmenté de 21,5 % et 22,5 % chez les animaux à dose moyenne et élevée respectivement après 1 mois (c et e).

Les rats à dose moyenne ont présenté une réduction significative de la PIO à 6 mois (Fig. 2c; test de comparaison multiple de Dunnett, p = 0, 01, N = 9) et une tendance significative à la diminution de la PIO a été notée au cours de la période de 12 mois (Fig. 2d ; régression linéaire simple, p = 0,0036) avec une réduction de la PIO de 21,88 % entre le départ et 12 mois.

Les rats traités à haute dose ont affiché une réduction significative de la PIO initiale à 6, 9 et 12 mois (Fig. 2e; test de comparaison multiple de Dunnett, p ≤ 0,0021, N = 10) avec une tendance très significative à la réduction de la PIO sur la période de 12 mois (Fig. 2f, régression linéaire simple, p < 0,0001). Les rats traités à haute dose ont présenté la plus forte réduction de la PIO par rapport au départ à 12 mois, avec une diminution globale de 43,22 %. Il est important de noter qu'aucun œil traité dans aucun groupe de dosage à aucun moment n'a montré de signes d'hypotonie (PIO ≤ 5 mmHg) tout au long de l'étude.

12 mois après l'injection, un rat mâle et un rat femelle de chaque groupe posologique ont été sacrifiés pour l'histologie, et les animaux restants ont été soumis à un régime alimentaire personnalisé contenant 5 % p/p de tétracycline pour « éteindre » l'expression génique par l'activation du TC40. et des éléments riboswitch TC45 incorporés dans le génome du vecteur. Après un mois de supplémentation alimentaire en tétracycline, la tonométrie a été répétée pour déterminer si la suppression de l'expression du transgène entraînait une réversion de la PIO vers une tension normale. Les rats BN injectés avec une faible dose du vecteur rAAV2/2[MAX].CCPP n'ont montré aucun changement significatif de la PIO par rapport aux évaluations de tonométrie post-injection ou à la ligne de base pré-injection, ce qui indique que l'administration de tétracycline n'a eu aucun impact direct sur la PIO ( Fig. 2a, test de comparaison multiple de Dunnett, p = 0,4461, N = 9). Il est important de noter que la PIO des rats BN injectés avec une dose moyenne de vecteur rAAV2/2[MAX].CCPP a démontré un retour presque complet à la tension normale, la PIO augmentant de 21,5 % par rapport aux mesures sur 12 mois (Fig. 2c, N = 6) . Les animaux à forte dose ont montré un retour significatif à la PIO initiale (Fig. 2e ; test de comparaison multiple de Dunnett, p = 0,0283, N = 7) avec une PIO moyenne augmentant de 22,5 % par rapport à 12 mois.

Pour évaluer si la biosynthèse de novo de PGF2α dans la chambre antérieure a des effets sur la santé rétinienne, nous avons effectué une ophtalmoscopie confocale au laser à balayage (cSLO) et une imagerie par tomographie par cohérence optique (OCT) au départ et à 12 mois pour détecter les altérations de la réflectance et de l'épaisseur de la rétine, respectivement. L'imagerie cSLO a révélé une augmentation de la réflectance dans le proche infrarouge (NIR) et une apparence de fond d'œil « rayée » à 12 mois dans les yeux non traités (contrôle) et rAAV2/2 [MAX]. 1a – d), moyenne (Fig. 1e – h supplémentaire) et élevée (Fig. 1i – l supplémentaire), suggérant que toute altération de la morphologie rétinienne observée s'est produite indépendamment du traitement ou de la dose et est plutôt probablement liée au vieillissement normal.

Cinq OCT B-scans moyens à travers la tête du nerf optique chez tous les animaux au départ et 12 mois après l'injection de rAAV2 / 2 [MAX] .CCPP ont été analysés dans l'analyse de réflectivité OCT (ORA) pour quantifier l'épaisseur de la rétine (Fig. 2 supplémentaire) 53 . 10 profils de réflectivité longitudinale (LRP) ont été générés à des incréments de 250 microns à partir du nerf optique et utilisés pour déterminer l'épaisseur de la rétine mesurée de la couche de fibres nerveuses rétiniennes jusqu'au RPE (Fig. 3). Une réduction significative de l'épaisseur de la rétine a été observée au bout de 12 mois dans les yeux non traités (Fig. 3a–c) et dans les yeux injectés avec le vecteur rAAV2/2[MAX].CCPP (Fig. 3d–f) par rapport au départ ; au moins une excentricité dans les groupes à dose élevée et faible a montré une signification (ANOVA à deux facteurs, test de comparaison multiple de Sidak, p = 0,0123–0,0335 (*), 0,0027–0,0087 (**), 0,0007 (***) et < 0,0001(****), N = 8/groupe), alors que les yeux traités par le rAAV à dose moyenne (Fig. 3e), ont montré un certain degré d'amincissement, mais n'ont pas atteint la signification (ANOVA à deux voies, test de comparaison multiple de Sidak, p > 0,1072, N = 6). Comme l'amincissement de la rétine a été démontré chez plusieurs espèces en fonction de l'âge et a été observé dans les yeux traités et non traités dans tous les groupes de dose, nous émettons l'hypothèse que l'épaisseur rétinienne réduite observée est également le résultat du vieillissement normal54,55,56,57,58 ,59,60.

Un amincissement significatif de la rétine a été observé à diverses excentricités du nerf optique à 12 mois pour les yeux non traités (a–c) et traités (d, f) par rapport aux mesures de base. Aucun amincissement significatif n'a été noté dans les yeux traités à dose moyenne (e). (ANOVA à deux facteurs avec test de comparaison multiple de Sidak post hoc, p = 0,0123-0,0335 (*), 0,0027-0,0087 (**), 0,0007 (***) et <0,0001 (****)). Éléments de la boîte à moustaches : moyenne = +, ligne centrale = médiane, limites de la boîte = 25e et 75e centiles, moustaches = min et max).

Pour déterminer si l'expression du transgène CCPP a un effet indésirable sur la fonction rétinienne, des enregistrements d'électrorétinogramme plein champ (ffERG) ont été collectés pour les yeux traités et non traités sur des rats adaptés à l'obscurité (Fig. 4). Aucune différence significative dans les amplitudes des ondes A ou B n'a été trouvée entre les yeux traités et non traités dans les groupes à faible dose (N = 11), à dose moyenne (N = 8) ou à dose élevée (N = 10) à n'importe quelle intensité (Fig. 4a–f ; plusieurs tests T non appariés p > 0,05 tous les groupes, Fig. 3 supplémentaire). Malgré les altérations liées à l'âge de l'apparence et de l'épaisseur de la rétine, l'intégrité fonctionnelle de la rétine dans les yeux traités et controlatéraux non traités a été maintenue sur une période de 12 mois d'expression omniprésente du transgène CCPP.

La quantification des amplitudes moyennes des ondes A et B de chaque groupe de dosage est indiquée (a–f). Aucun changement significatif n'a été trouvé entre les amplitudes traitées et non traitées pour les ondes A ou B (tests T multiples, p > 0,05 tous les groupes. N = 11, 8 et 10 pour les doses faible, moyenne et élevée respectivement. Éléments du diagramme en boîte : moyenne = +, ligne médiane = médiane, limites de la boîte = 25e et 75e centiles, moustaches = min et max).

Suite à l'administration intracamérulaire du vecteur rAAV2/2[MAX].CCPP chez des rats BN, nous avons cherché à étudier les effets de la biosynthèse de novo PGF2α sur la santé de la chambre antérieure en utilisant l'OCT pour déterminer l'épaisseur cornéenne centrale et la profondeur de la chambre antérieure. L'imagerie OCT de la cornée réalisée à 12 mois dans les yeux rAAV2/2[MAX].CCPP injectés (traités) et témoins (non traités) n'a révélé aucune différence significative dans l'épaisseur centrale de la cornée dans les faibles (p = 0,7541, N = 9 ), œil traité à dose moyenne (p = 0,7475, N = 6) ou élevée (p = 0,2931, N = 6,) (Fig. 5a–c ; toutes les comparaisons tests T non appariés). En revanche, l'imagerie OCT de la chambre antérieure a révélé une augmentation hautement significative et dose-dépendante de la profondeur de la chambre dans les basses (Fig. 5d, g ; +5,2 % p = 0,0125), moyennes (Fig. 5e, h ; +8,1 %, p = 0,0447) et élevée (Fig. 5f, i ; +24,3 %, p = <0,0001) yeux traités à la dose par rapport aux yeux témoins controlatéraux non traités (toutes comparaisons tests T non appariés).

L'épaisseur centrale de la cornée n'a pas été modifiée de manière significative entre les yeux non traités et traités, quel que soit le groupe de dosage (a–c). La profondeur de la chambre antérieure s'est avérée significativement augmentée dans les yeux traités avec une dose faible (d, g), moyenne (e, h) et élevée (f, i) par rapport aux témoins non traités. (Test T non apparié : p = 0,7541 (a), p = 0,0447 (b), p = 0,2931 (c), p = 0,0125 (d), p = 0,0447 (e) et p < 0,001 (f). N = 9, 6 et 6, respectivement pour les doses faible, moyenne et élevée. Barres d'erreur = SD).

Pour déterminer si l'expression du transgène CCPP ou la biosynthèse de novo de PGF2α provoque des réponses inflammatoires dans la chambre antérieure, des rats BN ont subi des examens à la lampe à fente 12 mois après le traitement à la recherche de preuves de dispersion cellulaire, de poussée ou de pigment, avec un classement effectué par 5 examinateurs masqués en ce qui concerne à la fois l'identité de l'animal et le traitement à l'aide d'un schéma de classement Hackett-McDonald et SUN modifié pour l'uvéite61, 62, 63, 64, 65, selon le cas (tableau supplémentaire 1). Une augmentation faible mais significative du nombre de cellules de la chambre antérieure a été observée dans les yeux injectés avec le vecteur rAAV2/2[MAX].CCPP à faible dose par rapport aux témoins (Fig. 6ap = 0,0165, N = 9), mais cette tendance ne s'est poursuivie ni dans l'un ni dans l'autre. les groupes de traitement à dose moyenne ou élevée (Fig. 6b, c, p = 0,7516 et 0,1099, N = 7 et 5 respectivement). De même, aucun groupe posologique n'a montré d'association significative entre le traitement par le vecteur rAAV2/2[MAX].CCPP et la présence d'une poussée (Fig. 6d – f ; p = 0,0952, p = 0,3938, p = 0,3451 respectivement). Inversement, il a été observé que la dispersion des pigments était significativement augmentée à faible (Fig. 6g, p = 0,0011), moyenne (Fig. 6h, p = 0,0020) et forte dose (Fig. 6i, p <0,0001 ; toutes les comparaisons Test exact de Fisher ) rAAV2/2[MAX].CCPP vecteur yeux injectés. De plus, un rat mâle et un rat femelle du groupe à dose élevée ont développé un hyphéma à 12 mois nécessitant une euthanasie.

Les photographies d'examen à la lampe à fente notées par 5 participants masqués ont été comparées entre les yeux non traités et traités pour chaque groupe de dosage pour la cellule (a – c), la lumière parasite (d – f) et la dispersion des pigments de l'iris (g – i). Un test exact de Fisher a révélé que dans le cas d'une cellule à faible dose (a), la présence de cellules dépendait de l'administration du vecteur, mais pas pour les groupes à dose moyenne ou élevée (b, c). Dans tous les cas de poussée, le test exact de Fisher a révélé que le score de poussée est indépendant de l'administration du vecteur (d–f). De même, tous les groupes posologiques ont présenté une exfoliation accrue de l'iris qui dépendait de l'administration du vecteur (g – i). (Test exact de Fisher : valeurs de p = 0,0165 (a), 0,7516 (b), 0,1099 (c), 0,0952 (d), 0,3938 (e), 0,2451 (f), 0,0011 (g), 0,002 (h) et <0,001 (i). N = 9, 7 et 5 pour les doses faible, moyenne et élevée respectivement).

La microscopie électronique réalisée post-mortem à 12 mois indique que la morphologie de l'iris s'est avérée modifiée entre les yeux non injectés et injectés, l'iris démontrant un amincissement progressif en fonction de l'augmentation de la dose de vecteur (Fig. 7a – d). La morphologie de l'endothélium cornéen était inchangée entre l'œil non injecté et les yeux injectés à des doses faibles, moyennes et élevées, ce qui indique que l'expression de la CCPP n'affecte pas négativement la morphologie des cellules endothéliales (Fig. 7e – h).

Des coupes de microscopie électronique de chaque groupe de dosage ainsi qu'un œil témoin non injecté du rat à forte dose ont été analysés pour les différences qualitatives dans l'iris (a–d) et l'endothélium cornéen (e–h). Alors que les cellules endothéliales cornéennes se sont avérées inchangées, un amincissement progressif a été noté dans l'iris à mesure que la dose de vecteur augmentait. Grossissement = 2000× ; barre d'échelle = 10 μm.

Comme l'inflammation chronique a été associée à la réduction de la PIO66,67,68, nous avons cherché à déterminer s'il existait une relation entre le score d'exfoliation des cellules, des poussées ou de l'iris et les mesures de la PIO après l'injection du vecteur rAAV2/2[MAX].CCPP à toutes les doses . Plus précisément, si la réduction de la PIO observée après rAAV2/2[MAX].CCPP est causée par la présence d'une inflammation chronique, une forte corrélation négative entre les scores d'inflammation élevés et la réduction de la PIO serait attendue. Les analyses de régression linéaire ne démontrent aucune corrélation significative entre la cellule (r2 = 0,02555), la poussée (r2 = 0,008490) ou l'exfoliation de l'iris (r2 = 0,000041 ; Fig. 8a – c). Pour déterminer si l'inflammation et la dose de vecteur sont des modificateurs covariants de la PIO, nous avons comparé la pente des régressions linéaires pour chaque métrique inflammatoire (cellule, poussée et exfoliation de l'iris) avec les mesures de la PIO et séparées par la dose de vecteur (faible ; N = 9, moyen ; N = 6, ou élevé ; N = 5 ; Fig. 4 supplémentaire). Un test de comparaison multiple de Tukey n'a révélé aucune différence significative dans les pentes de régression entre les doses pour toute mesure inflammatoire, y compris la cellule (p = 0,6316–0,6563), la poussée (p = 0,06436–0,6669) ou l'exfoliation de l'iris (p = 0,6166–0,6994) , indiquant fortement que l'inflammation oculaire et le dosage du vecteur rAAV2/2[MAX].CCPP ne sont pas des modificateurs de la PIO.

Les régressions linéaires corrélant la PIO à l'exfoliation des cellules, des poussées et de l'iris (a–c) ne montrent aucune corrélation entre la réduction de la PIO et l'inflammation observée dans la chambre antérieure. La coloration au trichrome de Masson indiquant une fibrose à base de collagène (colorant bleu) a été analysée qualitativement dans les yeux non traités (d–f) et les yeux traités controlatéraux (g–i) (grossissement = 20 ×, barre d'échelle = 150 µm), ne révélant aucune différence évidente entre les yeux traités et les yeux non traités à n'importe quelle dose.

Pour déterminer si la fibrose ou l'atrophie du corps ciliaire - qui peut potentiellement réduire la production d'humeur aqueuse et donc abaisser la PIO d'une manière indépendante de la thérapie - était évidente, une immunohistochimie a été réalisée en utilisant du trichrome de Masson, de l'hématoxyline et de l'éosine (H&E) et de l'acide périodique Schiff (PAS). La coloration au trichrome de Masson (Fig. 8d – i) n'a révélé aucune preuve d'augmentation de la fibrose (colorant bleu) dans rAAV2/2[MAX]. Yeux traités par CCPP par rapport aux yeux témoins controlatéraux non traités à n'importe quel groupe de dosage (Fig. 8d – i). La coloration H&E (Fig. 5 supplémentaire) et PAS (Fig. 6 supplémentaire) n'a révélé aucune différence évidente dans la morphologie du corps ciliaire entre les yeux traités et non traités à n'importe quel groupe de dosage, indiquant une absence d'atrophie du corps ciliaire.

Ensemble, ces données indiquent fortement que la réduction dose-dépendante de la PIO observée après le traitement par rAAV2/2[MAX].CCPP n'est pas associée à une inflammation à médiation vectorielle ou transgénique, où il n'y avait pas de corrélation significative entre les mesures inflammatoires, la dose, et la pression. En outre, il n'y avait aucune preuve de lésions anatomiques macroscopiques (fibrose ou atrophie) affectant le corps ciliaire pouvant indiquer une réduction substantielle de la production d'humeur aqueuse.

L'observance par les patients des thérapies pharmacologiques existantes (par exemple, les gouttes ophtalmiques) pour le glaucome à angle ouvert est extrêmement faible en raison d'une combinaison de faible tolérance, de difficultés d'auto-administration et d'un manque de rétroaction négative immédiate (par exemple, la douleur) pour renforcer le dosage approprié, conduisant fréquemment au développement de complications menaçant la vision, même chez les patients diagnostiqués tôt. Afin de réduire la non-observance des patients, d'améliorer les résultats visuels et de réduire le fardeau médical lié à l'adhésion à un régime de traitement quotidien, il y a donc eu un intérêt substantiel pour le développement de nouvelles thérapies qui agissent pour abaisser la PIO sur une période prolongée, y compris implantable les dispositifs médicamenteux et, plus récemment, la thérapie génique35,69,70,71. Ici, en utilisant une combinaison d'imagerie multimodale, de tonométrie, d'électrophysiologie et d'histologie post-mortem, nous démontrons l'efficacité et l'innocuité d'un vecteur rAAV injecté par voie intracamérulaire qui catalyse la biosynthèse de novo de PGF2α et de son récepteur à partir de cellules de l'angle iridocornéen et de l'endothélium cornéen. , entraînant une réduction dose-dépendante à long terme (12 mois) de la PIO. Fait important, nous démontrons que l'inclusion d'éléments de riboswitch sensibles à la tétracycline dans la construction d'expression permet d'inverser temporairement la réduction de la PIO grâce à la supplémentation d'un médicament activateur oral - une caractéristique de sécurité clé pour la traduction clinique qui permet soit l'arrêt du traitement à l'avènement de une infection concomitante (par exemple, une kératite herpétique) ou la capacité de personnaliser le dosage du gène au niveau d'expression optimal du transgène sur une base patient à patient.

Nos données démontrent que la dose était un facteur permettant d'obtenir une réduction optimale de la PIO et que, de manière critique, le degré de réduction de la pression intraoculaire dans les groupes à dose moyenne (-21,88 %) ou élevée (-43,22 %) correspondait ou dépassait celui obtenu avec le courant approches pharmacologiques, où des rapports antérieurs sur l'utilisation du latanoprost chez l'homme montrent une réduction moyenne de la PIO de 24 à 35 % après 2 ans de traitement continu15,72,73,74. La relation dose-dépendante claire entre le nombre de génomes de vecteurs administrés et la réduction observée de la PIO est particulièrement importante car elle indique que le traitement de thérapie génique proposé pour le GAO pourrait être personnalisé en fonction des besoins de chaque patient. Fait intéressant, bien que le dosage soit un facteur important pour obtenir la réduction souhaitée de la PIO, il a également été constaté que le nombre de génomes de vecteurs administrés était directement corrélé à notre capacité à inverser l'effet du traitement par l'activation des éléments riboswitch sensibles à la tétracycline TC40 et TC45 incorporés dans le CCPP. vecteur du génome comme élément de sécurité supplémentaire46. Lorsqu'ils ont été soumis à un régime de tétracycline pour réguler négativement l'expression du transgène post-transcriptionnelle pendant un mois, les rats BN du groupe à dose moyenne ont présenté un retour proche de la valeur initiale, tandis que les animaux à dose élevée n'ont démontré qu'une réversion partielle à la normotension, indiquant qu'il y a une mesure limitée auquel l'expression du transgène, et donc la réduction de la PIO, peut être inactivée à l'aide de l'itération actuelle de notre cassette d'expression. Une possibilité de ne pas observer un retour complet à la normotension chez les animaux traités à haute dose peut inclure le fait que la biosynthèse soutenue de PGF2α peut entraîner un remodelage irréversible de la voie de sortie uvéosclérale, bien que cela ne soit pas immédiatement évident en microscopie optique ou électronique. Une autre explication de la seule réversion partielle observée est la plage dynamique limitée des ribocommutateurs de tétracycline utilisés dans cette étude, dans laquelle nous avons précédemment démontré que les éléments TC45 et TC40 ont une plage dynamique relativement petite (réduction d'environ 4,6 fois) entre inactif et états actifs et ne "désactivent" pas complètement l'expression du transgène, ce qui rend probable que dans les yeux traités à forte dose, il y ait eu une biosynthèse résiduelle de PGF2α suffisante pour maintenir un degré de réduction de la PIO, même en cas de régime à base de tétracycline45. Si cela s'avérait correct, il serait alors avantageux pour les futures études et la traduction clinique de développer des riboswitches avec une plus grande plage dynamique et un niveau d'expression plus faible dans l'état actif « off ». Idéalement, étant donné les effets secondaires cliniques connus associés à l'utilisation à long terme de la tétracycline (par exemple, dysbiose intestinale et calcification dentaire) et les préoccupations croissantes liées à la résistance aux antibiotiques, tout nouveau ribocommutateur de ce type devrait être conçu pour répondre à un ligand activateur qui n'est pas un antibiotique et a une plus grande biodisponibilité que la tétracycline, dont il a été démontré qu'elle traverse de manière inefficace la barrière hémato-encéphalique75,76. Plusieurs ribocommutateurs alternatifs existent, y compris ceux avec une plus grande plage dynamique, y compris GuaM8HDV et TAP1, qui répondent respectivement à la guanidine HCL et à la théophylline, mais on ne sait pas si ces ligands sont facilement absorbés à travers la barrière hémato-aqueuse45,46,77,78, 79,80.

Notre étude a démontré que les effets de la surexpression du transgène CCPP ne semblent pas affecter négativement la morphologie ou la fonction rétinienne. Bien que l'analyse cSLO et OCT ait révélé un NIR accru et un amincissement rétinien significatif à diverses excentricités du nerf optique à 12 mois par rapport à la valeur initiale, ces changements se sont produits dans les yeux traités et non traités et étaient indépendants de la dose, où les yeux traités à faible dose (et témoins controlatéraux) ont présenté un amincissement rétinien plus important que ceux des animaux traités à dose moyenne ou élevée. En l'absence d'une relation dose-dépendante claire entre notre thérapie CCPP et une réflectivité accrue ou un amincissement rétinien, nous pensons que les changements observés sont liés au vieillissement normal, où l'amincissement rétinien, en particulier de la couche de fibres nerveuses rétiniennes, s'est déjà avéré corrèlent avec l'âge avancé chez les modèles humains, souris et rats54,55,56,57,58,59,60. Fait important, la fonction rétinienne telle qu'évaluée par ffERG n'a été affectée dans aucun groupe de dose sous aucun paramètre d'éclairage. Prises ensemble, ces données suggèrent que l'administration intracamérulaire de rAAV2/2[MAX].CCPP et la biosynthèse de novo de PGF2α sont bien tolérées et n'affectent pas négativement la santé ou la fonctionnalité rétinienne, avec des yeux non traités et traités dans chaque cohorte de dose montrant un degré similaire de réflectivité accrue et d'amincissement de la rétine et sans déficits fonctionnels observés par ffERG.

L'une de nos principales considérations lors de l'évaluation de l'efficacité de la thérapie génique proposée pour la réduction de la PIO était d'évaluer la santé de la chambre antérieure après l'administration de vecteur intracamérulaire et l'expression prolongée du transgène CCPP. L'épaisseur de la cornée s'est avérée inchangée entre les yeux non traités et les yeux traités à 12 mois, ce qui indique que notre traitement de thérapie génique n'affecte pas négativement la santé de la cornée et que les mesures de la PIO prises tout au long de l'étude n'auraient pas été confondues par des changements d'épaisseur de la cornée dans n'importe quel groupe de dose. De plus, l'EM a révélé que l'endothélium cornéen, la membrane de Descemet et le stroma avaient une morphologie normale sans aucun signe d'œdème, d'amincissement ou de délaminage, indiquant que l'intégrité de la cornée et de l'endothélium n'était pas compromise. Fait intéressant, nous avons observé une augmentation significative et dose-dépendante de la profondeur de la chambre antérieure, une constatation contrairement aux études précédentes indiquant que le traitement avec des analogues de prostaglandines entraîne une diminution de la profondeur de la chambre antérieure81,82. Cependant, ces études n'ont porté que sur les effets à court terme de l'utilisation du latanoprost et de la pilocarpine chez les patients glaucomateux, chez qui on peut s'attendre à ce que la profondeur de la chambre antérieure soit plus profonde que chez les témoins appariés selon l'âge et le sexe, en conséquence directe de l'élévation de la PIO82. En conséquence, il est possible que l'approfondissement de la chambre antérieure observé dans cette étude soit un artefact de l'utilisation d'animaux normotendus tout au long de l'étude, dont on s'attendrait à ce qu'ils aient des courbures cornéennes de base normales et puissent donc démontrer des altérations prononcées de la profondeur de la chambre lorsque la PIO est abaissé artificiellement par un traitement de thérapie génique. Alternativement, il est également possible que la biosynthèse de novo de PGF2α dans la chambre antérieure elle-même conduise à un remodelage uvéoscléral plus étendu que celui observé lorsque des analogues de prostaglandines sont appliqués localement sur la surface cornéenne, car seulement 5 à 10 % de chaque goutte est absorbée par la cornée et le reste est mal absorbé par les tissus environnants83,84,85,86. On ne sait toujours pas par quel mécanisme la biosynthèse intra-oculaire soutenue de PGF2α affecte la profondeur de la chambre antérieure, bien que l'OCT semble montrer que la cornée centrale des yeux à forte dose est plus incurvée, indiquant que la cornée a «gonflé», plutôt que le cristallin et l'iris se sont déplacés vers l'arrière. En plus de la réduction plus importante que souhaitée de la PIO dans les yeux à forte dose, l'approfondissement de la chambre antérieure est également préoccupant car il aurait probablement un impact négatif sur la vision du patient, où des études antérieures ont montré qu'après l'insertion de la LIO chez les patients atteints de cataracte, la partie antérieure des augmentations de profondeur de chambre de 1 mm peuvent provoquer un déplacement myope des erreurs de réfraction augmentant jusqu'à 0,32 dioptrie87,88.

La notation des cellules et des fusées éclairantes menée par des observateurs masqués n'a révélé aucune augmentation dose-dépendante significative de l'inflammation, indiquant que l'injection de rAAV dans la chambre antérieure et l'expression à long terme de la cassette du transgène CCPP sont bien tolérées. Inversement, alors que l'inflammation de la chambre antérieure s'est avérée négligeable, une dispersion de l'iris a été observée dans tous les groupes de dosage, les animaux recevant une dose élevée montrant des niveaux très significatifs de migration des mélanocytes fortement corrélés à l'amincissement de l'iris tel qu'évalué par microscopie électronique. Il n'est pas possible de déterminer à partir de la présente étude si l'exfoliation dose-dépendante de l'iris résulte de l'expression directe du transgène CCPP dans les mélanocytes, où le sérotype rAAV2/2[MAX] est capable de transduire les cellules de l'iris, ou s'il est liés à des concentrations croissantes de PGF2α dans la chambre antérieure à des doses de vecteur plus élevées. Quoi qu'il en soit, l'observation d'une dispersion pigmentaire dose-dépendante contre-indiquerait probablement l'utilisation de la thérapie génique rAAV.CCPP décrite pour abaisser la PIO chez les patients atteints de glaucome congénital (par exemple, Axenfeld-Rieger) ou de dispersion pigmentaire dont les iris peuvent déjà être instables et dont la dégradation peut être accélérée soit par la transduction de l'iris avec l'AAV soit par l'expression du transgène CCPP et la biosynthèse de PGF2α. Étant donné l'absence d'implication de l'iris dans la physiopathologie de l'hypertension oculaire dans le GAO (par opposition à l'angle fermé ou au glaucome congénital), il serait cependant probablement avantageux d'étudier la sélection de sérotypes de rAAV naturels ou artificiels qui ne transduisent pas l'iris en éliminer la possibilité que l'expression directe de la CCPP provoque une exfoliation de l'iris lors du traitement du GAO ou du glaucome à dispersion pigmentaire.

Une autre préoccupation majeure lors de l'évaluation de l'efficacité d'un traitement de thérapie génique qui fonctionne en modulant la biologie de la voie pour synthétiser la PGF2α de novo à partir des cellules de la chambre antérieure est de savoir si toute réduction observée de la PIO peut être attribuée non à l'action pharmacologique de la PGF2α sur le remodelage uvéoscléral. , mais par une inflammation chronique en réponse à l'injection de virions rAAV dans la chambre antérieure ou à l'expression ultérieure du transgène thérapeutique. Cette préoccupation est particulièrement pertinente lors de l'évaluation d'un nouveau traitement pour le glaucome, où une inflammation soutenue et de faible intensité est connue pour diminuer la PIO chez les patients humains, et peut donc également être une variable confondante dans des modèles animaux expérimentaux, tels que le rat Brown Norway66,67 ,68. En effectuant une série d'analyses de régression linéaire et de covariance, nous avons pu démontrer avec succès que la dose de vecteur (faible, moyenne ou élevée) et la sévérité de l'inflammation (classée en fonction de l'exfoliation des cellules, des poussées et de l'iris) ne sont pas des médiateurs significatifs de la réduction de la PIO. , ce qui indique fortement que la diminution dose-dépendante observée de la PIO dans les groupes de traitement était principalement médiée par l'action biologique du transgène CCPP délivré. En effet, la seule analyse de régression qui s'approchait de la signification statistique était la relation entre l'exfoliation de l'iris et la PIO dans le groupe de traitement à forte dose (Fig. 4I supplémentaire), qui tend vers une pente positive avec un score d'inflammation plus élevé corrélé à une PIO plus élevée ; la tendance exactement opposée à celle attendue si l'inflammation chronique était responsable de la réduction de la PIO observée dans cette étude.

Une limite à ce travail est que les yeux témoins non traités étaient controlatéral aux yeux injectés dans toutes les cohortes de doses. Plus précisément, des études ont montré que l'injection de rAAV dans un œil peut affecter l'œil controlatéral, comme on l'a vu dans les essais précliniques sur l'amaurose congénitale de Leber, dans lesquels de l'ADN viral a été trouvé à la fois dans la chambre antérieure, la rétine et les nerfs optiques injectés et non injectés. primates non humains après injection intravitréenne de vecteur89. Cela soulève la possibilité que les altérations de la réflectivité et de l'épaisseur de la rétine observées dans notre étude puissent provenir d'une diaphonie entre les yeux injectés et controlatéraux non injectés, plutôt que d'un vieillissement normal. Nous pensons que cela est peu probable, cependant, pour les raisons suivantes : (1) l'expression de CCPP et la production de PGF2α n'étaient pas suffisantes dans les groupes à faible dose pour modifier la PIO dans l'œil traité lui-même, et il semblerait donc illogique qu'une telle activité de faible niveau pourrait nuire à la santé de la rétine dans l'œil controlatéral non injecté ; (2) l'augmentation de la réflectivité et de l'amincissement de la rétine n'a pas été observée comme étant dépendante de la dose dans les yeux traités ou non traités, ce qui serait attendu si l'un ou l'autre était attribuable à la présence de génomes vecteurs ou à l'expression de PGF2α dans l'œil controlatéral, où la diaphonie serait à nouveau devrait être le plus élevé chez les rats BN traités à forte dose ; (3) des études antérieures ont montré que la profondeur moyenne de la chambre antérieure chez les rats BN est de 778 ± 42,7 microns, ce qui est similaire à nos résultats sur 12 mois dans les yeux non traités à toutes les doses ;90 (4) l'œil témoin présenté pour l'étude au microscope électronique a été obtenu à partir d'un rat traité à haute dose et n'a démontré aucun changement morphologique indésirable (p. ex., exfoliation/amincissement de l'iris), ce qui aurait été attendu si une diaphonie entre les yeux injectés et non injectés s'était produite.

En conclusion, le traitement de rats bruns norvégiens normotendus avec rAAV2/2[MAX].CCPP a entraîné une réduction dose-dépendante de la PIO, les yeux à dose moyenne présentant une réduction cliniquement pertinente de l'hypertension oculaire sans développement d'effets secondaires indésirables. De manière critique, la réduction de la PIO pourrait être inversée par l'administration d'un ligand oral, une caractéristique de sécurité essentielle pour la traduction clinique qui permet l'arrêt temporaire du traitement en cas d'effet indésirable ou de nécessité de résoudre une infection commensale. Alors que l'exfoliation de l'iris et l'approfondissement de la chambre antérieure ont été observés chez les rats BN traités à haute dose, ces animaux ont également présenté une réduction de la PIO plus importante que cliniquement pertinente et, en tant que telle, sembleraient représenter un surdosage du vecteur rAAV2/2[MAX].CCPP . Les recherches futures visant à déterminer les effets de cette thérapie dans des modèles animaux glaucomateux, ainsi que la découverte de la combinaison optimale du tropisme de la capside vectorielle et du riboswitch réglable pour limiter les effets secondaires observés à des doses élevées de vecteur augmenteraient la traduisibilité du médicament unique décrit à longue durée d'action. utiliser un traitement de thérapie génique pour le glaucome à angle ouvert.

Toutes les expérimentations animales ont été approuvées par le comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux du Medical College of Wisconsin et adhèrent à la déclaration de l'Association for Research in Vision and Ophthalmology pour l'utilisation d'animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle. Des rats BN âgés de 6 à 8 semaines (N = 30 : 15 mâles et 15 femelles) ont été obtenus auprès de Charles River Laboratories (BN/Crl, Wilmington, MA, USA) et logés dans une photopériode lumière/obscurité de 12 :12 h avec alimentation et eau fournies à volonté. De plus, 3 rats BN ont été obtenus pour des expériences de tropisme. Pour les évaluations nécessitant une anesthésie générale, les animaux ont été placés dans une chambre d'induction (VetEquip, Livermore, CA) et mis sous sédation par inhalation d'isoflurane (5 % d'induction, 1 à 2,5 % d'entretien) fourni dans de l'oxygène (100 %, 0,2 à 1 L/min ). La dilatation des pupilles a été obtenue par la mise en place de gouttes ophtalmiques mydriatiques topiques contenant 2,5 % de phényléphrine HCL et 1 % de tropicamide (Akorn, Lake Forest, IL, États-Unis).

Des cellules HEK293T (ATCC n° CRL-11268 ; Manassas, VA, États-Unis) ont été cultivées dans du DMEM à haute teneur en glucose + Glutamax (Gibco Life Technologies, Carlsbad, CA, États-Unis) additionné de 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) et de 1 % d'antibiotiques. antimycotique. Les cellules ont été ensemencées dans des plaques à six puits à une densité de 3,0 × 105 cellules/puits, puis transfectées à l'aide de polyéthylèneimine (PEI) (Polysciences, #23966-100, PA, USA) à ~70 % de confluence avec 2 µg de smCBA-TC40- Plasmide COX2-P2A-PTGFR-TC45 dans du sérum réduit (2 %) DMEM + milieu Glutamax. Après 72 h, le milieu a été récolté dans les puits et analysé en double à l'aide d'un kit ELISA commercial pour quantifier les niveaux de PGF2α (Abcam, ab133056, Cambridge, Royaume-Uni).

En bref, les cellules HEK293T ont subi une triple transfection avec (1) un plasmide exprimant les gènes Rep et Cap pour le vecteur rAAV2/2[MAX] mutant de capside ; (2) un plasmide auxiliaire exprimant des gènes dérivés d'adénovirus nécessaires à l'encapsidation ; et (3) le plasmide d'expression transgénique (smCBA-TC40-COX2-P2A-PTGFR-TC45 ; pour des informations sur la séquence, reportez-vous au brevet numéro US20200063137A1) dans des rapports équimolaires (1:1:1) utilisant PEI52. Les cellules ont été cultivées dans des hyperflasks (Corning, Corning, NY) pendant 72 h après la transfection dans du DMEM + Glutamax avec 2 % de FBS et 1 % d'antibiotique-antimycosique. Après 72 h, le vecteur a été purifié par centrifugation en gradient de densité d'iodixanol et concentration par échange de tampon, comme décrit précédemment91,92. Un total de 5 préparations de vecteurs de rAAV2/2[MAX]-smCBA-TC40-COX2-PTGFR-TC45 ont ensuite été combinés et concentrés par échange de tampon dans une colonne de filtre de 100 kDa pour augmenter les titres viraux (Amicon, Darmstadt, Allemagne). Les titres de rAAV ont été déterminés par un test PicoGreen (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) donnant 240 μl de 3,9 × 1013 vg/mL (génomes vecteurs/mL)93. Les vecteurs ont été dilués dans HBSS + 0,014 % de Tween-20 pour fournir une escalade de dose de trois logs pour l'injection : 3,9 × 109 vg/œil (faible), 3,9 × 1010 vg/œil (moyen) et 3,9 × 1011 vg/œil ( haut). Pour les expériences de tropisme in vivo, une seule préparation de vecteur de rAAV2/2[MAX]-smCBA-mCherry a été préparée de manière similaire au processus décrit ci-dessus, produisant 80 μl de 1,17 × 1013 vg/mL.

Trente rats BN ont été anesthésiés et leurs pupilles dilatées avant de recevoir une injection intracamérulaire unilatérale de rAAV2/2[MAX]-smCBA-TC40-COX2-P2A-PTGFR-TC45 à faible (3,9 × 109 vg), moyen (3,9 × 1010 vg), ou dose élevée (3,9 × 1011 vg) en suspension dans 10 μl de HBSS + 0,014 % de Tween 20 avec une petite quantité de fluorescéine pour visualiser le reflux. En bref, sous un microscope chirurgical ophtalmique (Leica, Wetzlar, Allemagne), une lamelle ronde en verre de 6 mm (Fisher Scientific, Pittsburg, PA, États-Unis) a été positionnée sur la surface cornéenne et fixée en position à l'aide d'un gel lubrifiant (2,5 % d'hypromellose, Akorn, Lake Forest, Illinois, États-Unis) avant que les pointes d'une pince droite crantée de 0,12 mm (#0109025, Haag-Streit John Weiss, Royaume-Uni) ne soient avancées en arrière du globe pour fixer un muscle extraoculaire et empêcher la rotation de l'œil. Une aiguille biseautée 33-G de 10 mm attachée à une seringue Hamilton de 100 ul a ensuite été avancée à travers la cornée d'environ 1 mm en avant du limbe jusqu'à ce que la pointe de l'aiguille soit au centre de la chambre antérieure. Après l'injection de 10 μl de vecteur purifié, la pointe de l'aiguille a été maintenue en position jusqu'à ce que la PIO se soit stabilisée - indiquée visuellement par l'élimination du stroma cornéen et la reprise de la perfusion rétinienne normale - pour limiter le reflux excessif. De même, trois rats BN ont subi des injections intracamérulaires bilatérales de rAAV2/2[MAX]-smCBA-mCherry pour des expériences de tropisme in vivo recevant 1,13 × 1011 vg chacun.

La pression intraoculaire a été mesurée avec un tonomètre à rebond portable TonoLab (iCare, Oy, Finlande) calibré pour une utilisation chez le rat au départ et 1, 2, 6, 9, 12 et 13 mois après l'injection. Toutes les lectures ont été effectuées sur des animaux non anesthésiés dans un délai défini (11h00-13h00) pour limiter la variabilité circadienne de la PIO ; tous les enquêteurs impliqués dans la prise de mesures de la PIO étaient masqués en ce qui concerne la dose de vecteur. En bref, le tonomètre a été fixé en position horizontale à l'aide d'un support de cornue et le rat a été positionné à l'aide d'une contrainte physique douce de sorte que l'œil de test soit à environ 1 mm et orienté perpendiculairement à la sonde du tonomètre. Chaque mesure de la PIO est la moyenne de trois enregistrements indépendants. Une fois l'évaluation terminée, les rats ont été récompensés par des friandises Bacon Yummies (Bio-Serv, Flemington, NJ, États-Unis) pour les conditionner à être manipulés sans anesthésie.

Les animaux ont subi des évaluations du fond d'œil préliminaires et sur 12 mois avec un cSLO multiligne personnalisé (Spectralis HRA modifié ; Heidelberg Engineering, Heidelberg, Allemagne). Après dilatation des pupilles, l'alignement de la caméra a été facilité grâce à l'utilisation du mode d'imagerie par réflectance dans le proche infrarouge (820 nm), garantissant que l'image du fond d'œil était uniformément éclairée et que le disque optique était correctement centré. Les images capturées sont des images uniques.

À 12 mois, tous les animaux ont subi une biomicroscopie à la lampe à fente (Topcon SL-D8Z, Topcon Medical Systems, Oakland, Californie, États-Unis) avec des images d'yeux traités et non traités capturées à l'aide d'un appareil photo numérique (D810, Nikon, Japon). Pour évaluer la cellule et la lumière parasite, une image de lampe à fente a été générée à l'aide d'un faisceau à fente de 1 mm qui englobait le diamètre du globe et l'exfoliation de l'iris a été évaluée sur des images à champ large obtenues avec un faisceau de 20 mm. Pour le classement, les images de la lampe à fente ont été rendues anonymes et présentées à cinq évaluateurs indépendants dans un ordre aléatoire pour s'assurer que les évaluateurs étaient masqués en ce qui concerne à la fois la dose de vecteur et l'identité de l'animal. Le classement a été effectué conformément au schéma de classement SUN pour la cellule et l'évasement de la chambre antérieure et à un schéma de classement Hackett-McDonald modifié pour l'exfoliation de l'iris (tableau supplémentaire 1).

Les rats BN ont subi des évaluations par électrorétinographie au départ et 12 mois après l'injection. Les rats ont été adaptés à l'obscurité pendant la nuit et toutes les manipulations expérimentales ont été effectuées sous un éclairage rouge faible. Un système Espion E2 attaché à un dôme couleur (Diagnosys LLC, Cambridge, Royaume-Uni) avec des filtres Bessel installés pour 0, 1000 et 60 Hz positionnés dans une cage de Faraday pour réduire le bruit électrique a été utilisé pour l'enregistrement. Après anesthésie à l'isoflurane, les rats ont été placés sur une scène chauffée pour maintenir la température corporelle tandis que les gouttes oculaires lubrifiantes Refresh ont été appliquées sur les cornées pour maintenir l'hydratation et assurer la conductivité électrique. Des électrodes sous-cutanées à noyau solide ont été insérées dans le cuir chevelu et le cuissot servant respectivement d'électrodes de référence et de masse, tandis que des électrodes à boucle en fil d'or ont été placées sur la cornée des deux yeux. Les réponses ont été enregistrées après de brefs (4 ms) stimuli de flash blanc unique (1 Hz) sur une série de luminance de 6 logs (-4 à 0,48 log cd.s/m2). Les amplitudes des ondes A et B ont été mesurées à l'aide du logiciel Espion E2 (Diagnosys LLC, Cambridge, Royaume-Uni).

La tomographie par cohérence optique rétinienne (OCT) a été réalisée sur des rats BN au départ et à 12 mois. L'imagerie a été réalisée à l'aide d'un OCT Bioptigen Envisu R2200 Spectral Domain (Leica Microsystems, Wetzlar, Allemagne) équipé d'un alésage spécifique à la rétine de rat. Des scans de volume rectangulaires ont été obtenus (1000 A-scans/B-scan, 650 B-scans) de la rétine et des images exportées vers le logiciel FIJI avec le plug-in de lecteur OCT installé, où 5 images centrées sur le disque optique ont été moyennées. Les images résultantes ont ensuite été exportées vers le logiciel OCT Reflectivity Analysis (ORA) où les mesures ont été enregistrées pour l'épaisseur de la rétine de la NFL au RPE à 10 profils de réflectivité longitudinaux à des excentricités de 250 microns du disque optique53. L'OCT de chambre antérieure a été complété à 12 mois sur l'OCT R2200 avec un alésage télécentrique de 12 mm (1000 A-scans/B-scan, 650 B-scans). Les images capturées ont été mesurées avec des compas pour l'épaisseur cornéenne centrale et la profondeur de la chambre antérieure dans le logiciel Bioptogen InVivoVue.

Des globes entiers injectés avec rAAV2.2[MAX]-mCherry ont été énucléés et fixés pendant la nuit dans du paraformaldéhyde (PFA) à 4 % à 4 °C. Les yeux ont ensuite été déplacés vers une solution de saccharose à 30 % dans du PBS pendant 24 h à 4 °C avant d'être rincés dans du PBS et intégrés dans un milieu à température de coupe optimale Tissue-Tek (Sakura, Torrance, CA). Les blocs OCT ont ensuite été sectionnés par incréments de 14 µm sur un cryostat Leica CM1860 (Leica, Buffalo Grove, IL) sur des lames Fisherbrand Superfrost Plus et laissés sécher pendant la nuit. Les coupes ont été conservées à -20 °C jusqu'à utilisation. Les échantillons ont été décongelés à température ambiante pendant 2 h, OCT lavé dans du PBS et les sections contre-colorées avec Hoechst 33342 pour visualiser les noyaux. Les sections ont été imagées avec un microscope confocal Nikon Eclipse 80i (Nikon, Minato, Tokyo, Japon) en utilisant l'objectif 20 × et traitées comme des projections d'intensité maximale et fusionnées dans le logiciel FIJI.

Des globes entiers injectés avec le vecteur du transgène CCPP ont été fixés dans du PFA à 4 % pendant la nuit et les tissus ont été déshydratés avec de l'éthanol gradué, nettoyés avec du xylène, infiltrés de paraffine (Sakura Tissue Tek-VIP5 ; processeur de tissus automatisé) et intégrés dans des blocs de tissus (Tissue Tek-TEC , centre d'encastrement). Les blocs de tissus ont été sectionnés à 4 µm (Microm HM355s) et montés sur des lames enduites de poly-L-lysine. Les sections ont ensuite été déparaffinées avec du xylène, réhydratées et colorées avec de l'hématoxyline et de l'éosine à l'aide d'une plate-forme de coloration automatisée (Sakura Prisma) et colorées manuellement pour l'acide périodique Schiff et Masson trichrome en utilisant un protocole standard développé par le Medical College of Wisconsin's Children's Research Institute Histology Core.

Des globes entiers de chaque groupe de dosage alloués pour la microscopie électronique à transmission ont été énucléés et fixés dans du paraformaldéhyde à 2 %, du glutaraldéhyde à 2 % dans un tampon de cacodylate de sodium 0, 1 M pendant une nuit à 4 ° C. Après la fixation, la dissection des globes pour obtenir des échantillons contenant la cornée, l'angle iridocornéen et la rétine antérieure a été achevée et les tissus post-fixés dans du tétroxyde d'osmium à 1 % sur de la glace. Après la post-fixation, le tissu a été déshydraté dans une série de méthanol (50 à 100 %) et infusé avec de l'acétonitrile. Les échantillons de tissus ont ensuite été intégrés dans 100% Embed 812 (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA) et cuits à 60 ° C pendant la nuit. Les échantillons intégrés ont été traités par le Medical College of Wisconsin Electron Microscopy Core, où des sections de 70 nm ont été réalisées à l'aide d'un ultramicrotome PowerTome MT-XL (RMC Boeckeler, Tucson, AZ, USA), placées sur des grilles hexagonales de 200 mesh (Electron Microscopy Science) et colorées avec de l'acétate d'uranyle et du citrate de plomb. Les sections colorées ont été imagées sur un microscope électronique à transmission H-600 (Hitachi High Technologies, Schaumburg, IL, USA) à un grossissement de 2000 ×.

Toutes les analyses statistiques ont été effectuées dans GraphPad Prism 7 (GraphPad, La Jolla, Californie, États-Unis) pour déterminer la signification statistique entre les groupes. Un test de Shapiro-Wilk a été utilisé pour déterminer que tous les ensembles de données étaient normaux (α = 0,05). Des tests T non appariés ont été utilisés pour analyser les données ELISA, la profondeur de la chambre et l'épaisseur cornéenne. Une ANOVA bidirectionnelle avec le test post hoc de comparaison multiple de Sidak a déterminé des différences significatives dans les données d'épaisseur de la rétine. Plusieurs tests T non appariés ont été utilisés pour déterminer les différences entre les données ERG. Une analyse à effets mixtes avec un test post-hoc de comparaisons multiples de Dunnett et une régression linéaire simple a été utilisée pour analyser les données de la PIO. Les données de la lampe à fente ont été analysées à l'aide d'un test exact de Fisher. Pour déterminer si une corrélation entre la réduction de la PIO et l'inflammation était évidente, des régressions linéaires simples pour les paramètres inflammatoires par rapport à la PIO à 12 mois ont été réalisées. De plus, pour tester si l'inflammation était un médiateur de la réduction de la PIO, les pentes de régression linéaire pour chaque groupe de dosage ont été comparées avec un test de comparaison multiple de Tukey.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Toutes les données nécessaires pour évaluer les conclusions de l'article sont présentes dans l'article et/ou les documents supplémentaires. Les données brutes utilisées pour générer les chiffres de la PIO, de l'OCT, de l'ERG et de la lampe à fente sont disponibles sur Figshare à l'adresse suivante https://doi.org/10.6084/m9.figshare.21280383. Toute autre demande pourra être communiquée à l'auteur correspondant.

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Les auteurs tiennent à remercier Clive Wells et Robert Goodwin du noyau de microscopie électronique du Medical College of Wisconsin et Christine Duris et l'équipe du noyau d'histologie de l'Institut de recherche pour enfants pour leur aide dans le traitement et l'imagerie des tissus. Les auteurs tiennent également à remercier Amira Pavlovich pour son aide dans l'enregistrement de la PIO. Les auteurs remercient également Ryan Conrardy, un biostatisticien du Medical College of Wisconsin, pour sa contribution à l'analyse des données. Nous tenons également à remercier le Dr Elena V. Semina et le Dr Michael J. Dunn pour avoir obtenu un financement qui a aidé à soutenir cette recherche (numéro de prix du National Eye Institute T32EY014537-EVS, National Eye Institute - R01EY032478, & National Center for Research Resources of le programme d'amélioration des installations de recherche des NIH - C06RR016511-MJD).

Département de biologie cellulaire, neurobiologie et anatomie, Medical College of Wisconsin, Milwaukee, WI, États-Unis

Kristina J. Chern, Christopher A. Reid et Daniel M. Lipinski

Département d'ophtalmologie et des sciences visuelles, Medical College of Wisconsin, Milwaukee, WI, États-Unis

Kristina J. Chern, Emily R. Nettesheim, Christopher A. Reid, Nathan W. Li, Gavin J. Marcoe et Daniel M. Lipinski

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Conceptualisation : DML et CAR Méthodologie : DML, CAR, ERN et KJC Enquête : CAR, ERN, KJC, NWL et GJM Rédaction (ébauche originale) : KJC et DML Rédaction (révision et édition) : KJC, CAR, ERN, DML , et GJM Supervision : DML Financement acquisition : DML

Correspondance à Daniel M. Lipinski.

Les auteurs déclarent les intérêts suivants : DML et CAR détiennent un brevet couvrant le transgène utilisé (CCPP) dans ce travail. ERN, KJC, NWL et GJM n'ont aucun intérêt concurrent à déclarer.

Communications Biology remercie Mathias Seeliger et le(s) autre(s) relecteur(s) anonyme(s) pour leur contribution à la relecture par les pairs de ce travail. Rédacteurs en chef de la manipulation principale : Chiea Chuen Khor et Eve Rogers.

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Réimpressions et autorisations

Chern, KJ, Nettesheim, ER, Reid, CA et al. Thérapie génique du glaucome médiée par le rAAV à base de prostaglandines chez des rats Brown Norway. Commun Biol 5, 1169 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04134-w

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Reçu : 17 janvier 2022

Accepté : 19 octobre 2022

Publié: 03 novembre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-022-04134-w

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Thérapie génique (2023)

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